家蠶30kD載脂蛋白19G1的表達和功能的初步研究.pdf

1、30K蛋白家族是一類在氨基酸組成及免疫學活性上相似的蛋白,分子量約為30 kD。家蠶30K蛋白是由脂肪體合成的非雌特異性脂蛋白,表達受保幼激素的調節(jié),是生長發(fā)育過程中主要儲藏蛋白之一,是五齡幼蟲及蛹主要的蛋白組分,主要分布在血淋巴中。對雌性家蠶,30K蛋白還是卵黃原蛋白的重要組成部分。30K蛋白中研究比較多的是30 kD載脂蛋白6G1和19G1。Kim EJ與Park HJ別把家蠶30Kc6基因構建入表達載體在大腸桿菌中表達得到重組蛋白

2、,純化后添加到哺乳動物及昆蟲細胞培養(yǎng)基中,能抑制哺乳動物及昆蟲細胞的凋亡;KooTY[5]等構建了表達重組30Kc6基因的生產干擾素的CHO細胞系,結果表明30Kc6基因的表達抑制細胞的凋亡并提高干擾素的產量。
　　 本研究從家蠶蛹cDNA文庫中通過生物信息學分析發(fā)現一條低分子量30 kD載脂蛋白19G1前體(low molecular mass30 kD lipoprotein19G1 precursor)的EST序列(Gen

3、Bank登錄號:AY568957)。生物信息學分析結果表明該基因ORF不含內含子,由長為771 bp的單一外顯子編碼256個氨基酸殘基的蛋白質,預測分子量約為29.5 kD,等點電為7.290。我們將其ORF克隆到原核表達載體pET-28a(+)中,構建重組質粒,雙酶切鑒定及序列測定正確后轉化大腸桿菌BL21(DE3),經IPTG誘導表達的重組蛋白以包涵體形式存在,經過鎳柱親和層析純化后獲得高純度的目的蛋白,以該重組蛋白作為抗原免疫新西

4、蘭大白兔制備多克隆抗體,經ELISA檢測,抗體效價可達1:12800,Western blotting結果顯示抗體的特異性較好。
　　 提取家蠶各個時期和五齡幼蟲各組織的總RNA分別進行熒光定量PCR分析結果表明,家蠶發(fā)育時期在蛹期轉錄水平最高,卵中最低;五齡幼蟲時期在脂肪體中轉錄水平較高,絲腺和腸較低。提取家蠶各發(fā)育時期以及家蠶五齡幼蟲各組織蛋白進行Western blotting分析,結果表明,該蛋白在家蠶蛹中及五齡幼蟲的脂