無(wú)色孔雀石綠單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、孔雀石綠（MG）是一種抗寄生蟲(chóng)和抗細(xì)菌類(lèi)藥物，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，用于預(yù)防與治療各類(lèi)水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鰓霉病等，并獲得了極佳的效果。由于MG及其代謝產(chǎn)物無(wú)色孔雀石綠（LMG）在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)具有明顯的高殘留、高毒性、致癌、致畸、致突變等副作用，該藥在動(dòng)物食品中的殘留問(wèn)題已經(jīng)引起了人們的高度重視，許多國(guó)家都將MG列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥。
　　 目前，國(guó)內(nèi)外建立了理化分析和微生物方法，如薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、

2、高效液相-熒光檢測(cè)法（HPL-CFLD）等，但因設(shè)備昂貴和檢測(cè)效率低，而無(wú)法適合于規(guī)模篩選。間接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫法（ciELISA），具有快速、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于藥物殘留的分析，獲得高質(zhì)量的單克隆抗體（McAb）是實(shí)現(xiàn)免疫分析的核心。與多克隆抗體（PcAb）相比較，McAb具有特異性強(qiáng)、均質(zhì)性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)勢(shì)。國(guó)外已有成套的MG及其代謝物L(fēng)MG的ELISA試劑盒上市，但我國(guó)用于MG檢測(cè)的ELISA試劑盒主要依賴(lài)進(jìn)口。

3、因此，本研究對(duì)探索制備高質(zhì)量的McAb，為自主研制ELISA試劑盒打下良好基礎(chǔ)。
　　 本試驗(yàn)用人工合成的無(wú)色孔雀石綠．牛血清白蛋白（LMG-BSA）作免疫抗原，分別免疫6～8周齡健康BALB/c小鼠?？扇苄钥乖庖咴匀酰话阋幼魟?，常用佐劑有弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑。四免以后，小鼠血清ciELISA效價(jià)均達(dá)到1：10000以上，小鼠產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體，證明合成的LMG-BSA免疫原性較好，能使機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。<

4、br>　　 采用50％ PEG作為促融劑，將免疫脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。融合后3～5d，可見(jiàn)呈葡萄狀分布的融合細(xì)胞小集落克隆，細(xì)胞數(shù)多少不等。經(jīng)鑒定：本試驗(yàn)獲得的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目為99.12±3.6，小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為40，而SP2/0骨髓瘤細(xì)胞為62.24±2.8條，說(shuō)明2E6細(xì)胞株確實(shí)為SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞的雜交細(xì)胞。細(xì)胞融合率為86.32％，其中單個(gè)細(xì)胞克隆分泌抗體陽(yáng)性率為4.56％。經(jīng)過(guò)對(duì)雜交瘤

5、細(xì)胞的篩選和克隆化，共獲得6株雜交瘤細(xì)胞株，從中篩選出1株效價(jià)高、特異性強(qiáng)的穩(wěn)定分泌LMG單克隆雜交瘤細(xì)胞株，命名為2E6。經(jīng)過(guò)3次亞克隆，克隆陽(yáng)性率達(dá)100％。經(jīng)多次凍存及復(fù)蘇，雜交瘤細(xì)胞仍能保持穩(wěn)定的抗體分泌能力。
　　 用ciELISA測(cè)定顯示LMG50％抑制質(zhì)量濃度為20.39ng/mL，誘生小鼠腹水的抗體效價(jià)達(dá)1：2.3×106。采用ciELISA計(jì)算出2E6 McAb與各種化合物的交叉反應(yīng)率，結(jié)果表明，2E6 McA