pcDNA3(-)SVT重組質粒的構建及其在小鼠小腸上皮細胞中的表達.pdf

1、小腸是營養(yǎng)物質吸收的主要場所，小腸上皮細胞(Intestinal epithelial cells，IEC)是腸道主要的功能細胞，參與腸道食糜的消化、吸收、免疫屏障和應激反應等，并與腸道的內、外分泌功能有密切關系。原代培養(yǎng)小腸上皮細胞費時費力，傳代次數(shù)有限，在體外長期培養(yǎng)條件下，細胞生理功能容易變異，造成試驗結果因細胞代數(shù)不同而難以比較。建立永生化小腸上皮細胞系，可以為研究腸道微生態(tài)營養(yǎng)和小腸上皮細胞的增殖分化提供重要的研究工具。本文旨

2、在利用SV40T能促進細胞永生化的功能，構建含有SV40T基因的真核表達載體，將重組克隆轉染小鼠小腸上皮細胞，進行小鼠小腸上皮細胞的永生化研究，為永生化小鼠小腸上皮細胞系的建立提供參考依據(jù)。 設計并構建pcDNA3(-)SVT真核表達載體。PVUII酶切改造pcDNA3真核表達載體，改造產(chǎn)物命名為pcDNA3(-)，XhoII酶切pGEM-LT，電泳膠回收得到SV40T基因片段，將其插入pcDNA3(-)真核表達載體，PSTI酶

3、切連接產(chǎn)物，通過瓊脂糖電泳篩選出插入方向正確的連接產(chǎn)物，并將其送生物公司測序。 探索小鼠小腸上皮細胞的分離純化方法，得到純度較高的小鼠小腸上皮細胞。以胎鼠小腸為材料，通過組織塊培養(yǎng)法進行原代小鼠小腸上皮細胞的體外培養(yǎng)，采用刮除法和相差消化及相差貼壁法對細胞進行純化，用0.05％ Trypsin-EDTA進行消化傳代，通過形態(tài)學觀察和免疫組織化學進行鑒定。 將SV40 T基因導入小鼠小腸上皮細胞，進行永生化研究。采用脂質體

4、轉染法，將編碼SV40 T基因的真核表達載體pcDNA3(-)SVT導入經(jīng)純化的小鼠小腸上皮細胞，以pEGFP-N1為報告基因檢測轉染效率，通過PCR和RT-PCR檢測SV40 T基因在小鼠小腸上皮細胞中成功表達。 結果表明：真核表達載體pcDNA3(-)SVT構建成功，為利用SV40 T抗原進行真核細胞永生化研究提供了穩(wěn)定、可靠的分子工具。通過組織塊培養(yǎng)法得到的小鼠小腸上皮細胞生長狀況良好，增殖旺盛，經(jīng)過純化，得到了純度較高的