一種綿羊生殖道抗菌肽cDNA的克隆、真核表達(dá)及特性研究.pdf

1、抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，成為宿主先天免疫的重要組成部分。因其具有抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、耐熱性好、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)而深受人們的關(guān)注。ORTAP40是從中國(guó)美利奴綿羊生殖道分離的一種新型的陽(yáng)離子抗菌肽，在早期的防御中起到了重要的作用。 本研究根據(jù)ORTAP40 N端氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，利用3'RACE技術(shù)克隆了綿羊生殖道抗菌肽3'末端全長(zhǎng)cDNA序列，并將其克隆之pMD18-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序鑒定正確的載體質(zhì)粒命名為

2、pMD18-T-ORTAP40，并登陸GenBank，登錄號(hào)為FJ514476，經(jīng)過(guò)cDNA序列分析顯示，ORTAP40是一個(gè)4.8kD的小肽，與分離純化的分子量一致。為得到大量抗菌肽純品，進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性，首先，參照畢赤巴斯德酵母（Pichia pastoris）密碼子偏好性，設(shè)計(jì)合成了ORTAP40成熟肽目的基因片段，所合成的ORTAP40基因全長(zhǎng)120bp，通過(guò)基因重組的方法將目的基因克隆到pPIC3.5K表達(dá)載體中，成功構(gòu)

3、建了重組酵母胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5K-ORTAP40；其次，用SalⅠ將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-ORTAP40線性化后采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母宿主菌GS115，插入到畢赤酵母染色體的高效啟動(dòng)子AOXI的下游，用高濃度的G418抗生素篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，以重組畢赤酵母的菌液為模板，進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性重組酵母轉(zhuǎn)化子每24h添加0.5％甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果表明產(chǎn)物分子量約為4.8KD左右；最后

4、，Trizol法提取酵母總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增ORTAP40基因，結(jié)果顯示表達(dá)期的酵母細(xì)胞中存在ORTAP40 mRNA，進(jìn)一步表明ORTAP40在酵母中存在表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)凝膠過(guò)濾色譜處理后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌（ATCC2002）、鏈球菌（ATCC55121）、大腸桿菌（ATCC25922）具有明顯的抑菌作用。隨后，利用高效液相色譜技術(shù)對(duì)重組表達(dá)的ORTAP40進(jìn)行了定性分析，結(jié)果表明，ORTAP40在巴斯德