人MxA基因轉基因小鼠及轉基因克隆豬的制備與分析.pdf

1、Mx蛋白是Ⅰ型干擾素(IFNα/β)誘導下產生的具有GTPase活性的抗病毒蛋白,對多種負鏈RNA病毒具有抵抗力,現(xiàn)已被應用到動物抗病育種領域中。相關研究資料表明,開展Mx蛋白研究很有科學意義和醫(yī)學應用價值。
　　 人的Mx基因位于第21號染色體上,人類細胞在受到Ⅰ型干擾素誘導后可表達出兩種Mx蛋白分別為MxA和MxB。其中,MxA蛋白具有廣譜的抗病毒效應,能保護機體免受流感病毒、麻疹病毒、水泡性口炎病毒等的侵染,MxB蛋白無抗

2、病毒活性。
　　 鑒于MxA基因在抗病毒方面的顯著功效,為進一步深入研究MxA蛋白的抗病機理,為動物抗病育種研究奠定基礎,本研究采用受精卵原核顯微注射法將本室構建的包含人MxA基因cDNA序列的外源片段導入受精卵的原核中,通過胚胎移植制備了高效表達人MxA蛋白的轉基因小鼠,以研究這些轉基因小鼠對流感病毒的抗病性,并探討了外源基因在轉基因動物傳代過程中的遺傳規(guī)律。此外,本研究還通過體細胞核移植技術制備了攜帶有人MxA基因的轉基因克

3、隆豬,為研究MxA蛋白在大動物抗病育種中的作用奠定基礎。
　　 在本論文的第二部分介紹了含有人MxA基因全長cDNA序列的pEGFP-MxA-Cl載體的構建,并轉染C2C12細胞驗證了載體的有效性。
　　 論文第三到第五部分介紹了顯微注射生產轉基因小鼠技術平臺的建設,并利用顯微注射的方法構建了MxA轉基因小鼠。將含人MxA cDNA的質粒經酶切線性化并純化后,通過顯微注射導入到小鼠受精卵的雄原核中,并將注射后狀態(tài)良好的受

4、精卵回輸至假孕受體母鼠的輸卵管中,共獲得55只后代小鼠。PCR鑒定共獲得15只陽性鼠,進一步對PCR陽性的小鼠基因組DNA做Southern blot鑒定,檢測出5只為轉基因陽性,轉基因陽性率約為10.9％。PCR和Southern blot雙陽性的MxA轉基因小鼠與正常ICR小鼠雜交以建立轉基因小鼠品系(命名為TG-1、TG-3、TG-4、TG-6和TG-12)。F1代和F2代的PCR鑒定結果表明,TG-1、TG-3、TG-6和TG-

5、12Founder鼠的轉基因可穩(wěn)定遺傳給后代。其中品系TG-6的2只F2經測交實驗證實為轉基因純合子,已完成建系任務。同時,經RT-PCR和Western blot分析,發(fā)現(xiàn)5個MxA轉基因小鼠品系的肺臟中都有MxA蛋白的表達。對TG-3的轉基因多組織表達分析表明:在CMV啟動子驅動下,MxA轉基因可在肺臟、脾臟、腎臟、心臟等部位表達。
　　 論文第六部分利用脂質體介導的方法將來源于人的MxA基因轉染至大白豬胎兒成纖維細胞中,所

6、用載體為pCMV-eGFP-MxA表達載體,帶有新霉素抗性(Neomycin,Neo)基因和綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)雙篩選標記。采用600μg/mL G418藥物濃度連續(xù)10d篩選得到陽性克隆細胞株,經PCR鑒定后確定為陽性的細胞作為細胞核供體與體外成熟42h的豬卵母細胞構建重構胚,移入自然發(fā)情的受體豬輸卵管中,經過正常的體內發(fā)育過程,有1頭轉基因克隆豬出生。PCR和Southern雜交

7、檢測結果顯示:獲得的轉基因克隆豬的基因組中整合有MxA基因。
　　 本論文已完成MxA轉基因小鼠和轉基因克隆豬模型建立,為在動物個體水平進一步深入揭示MxA的抗病機理奠定了基礎,為動物抗病育種提供了良好的動物模型。
　　 綜合以上結果可以得出以下結論:
　　 1.應用顯微注射法成功建立了轉人MxA基因的轉基因小鼠模型。
　　 2.由CMV啟動子指導的人MxA表達載體。pEGFP-MxA-C1能夠在轉基因小