前列腺素e2對(duì)成骨細(xì)胞力學(xué)敏感性的調(diào)控作用

1、<p>　　前列腺素E2對(duì)成骨細(xì)胞力學(xué)敏感性的調(diào)控作用</p><p>　　龔嘯元1，2，楊柳2，潘君1</p><p>　　（1重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044）</p><p>　?。?第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，重慶 400038）</p><p><b>　　摘要</b></p>

2、<p>　　目的：骨組織的大小、形狀以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)與其所受到的力學(xué)刺激有著極為密切的關(guān)系。PGE2能夠通過(guò)調(diào)控骨生成作用與骨消融作用之間的平衡而促進(jìn)骨密度的增加，但其細(xì)胞學(xué)機(jī)理尚不明了。本研究試圖將PGE2與成骨細(xì)胞力學(xué)敏感性進(jìn)行聯(lián)系，為解答PGE2在骨組織中促合成作用提供重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。</p><p>　　方法：本研究采用了胞內(nèi)鈣離子實(shí)時(shí)觀測(cè)方法記錄MC3T3-E1細(xì)胞中鈣離子濃度的變化。通過(guò)使用

3、dmPGE2對(duì)細(xì)胞進(jìn)行15分鐘的預(yù)處理，并觀察其對(duì)鈣離子信號(hào)的調(diào)控作用；采用PKA信號(hào)通路的激活及與阻滯劑檢驗(yàn)PKA信號(hào)通路在dmPGE2對(duì)細(xì)胞鈣離子信號(hào)調(diào)控過(guò)程中的參與作用。</p><p>　　結(jié)果：dmPGE2能夠提升MC3T3-E1細(xì)胞的力學(xué)敏感性；PKA信號(hào)通路在此過(guò)程中起參與作用。</p><p>　　結(jié)論：結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，我們認(rèn)為dmPGE2通過(guò)PKA信號(hào)通路調(diào)控細(xì)

4、胞骨架中的微絲強(qiáng)度，增強(qiáng)了MSCC的開(kāi)放程度，繼而增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的力學(xué)敏感性。本研究的結(jié)論為解釋PGE2在骨組織中的促合成作用提供重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。提示PGE2可能成為治療骨合成相關(guān)疾病的潛在目標(biāo)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：力學(xué)刺激；成骨細(xì)胞；力學(xué)敏感性；細(xì)胞骨架</p><p>　　________________</p><p>　　作者簡(jiǎn)介：龔嘯元、男、博

5、士研究生、生物力學(xué)、發(fā)表論文數(shù)量：3、聯(lián)系方式（電話：18716427965、E-mail: sliegxy@gmail.com）</p><p>　　[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(11272366; 11172207; 10972243)；重慶大學(xué)“生物流變科學(xué)與技術(shù)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室訪問(wèn)學(xué)者基金（No. CQKLBST-2012-002）</p><p>　　通訊作者：潘君、聯(lián)

6、系電話：18983399552、E-mail: panj@cqu.edu.cn</p><p>　　PGE2 Modulated Mechanosensitivity in Osteoblasts</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Objective: The size, shape and intern

7、al structure of bone is highly related to its mechanical environment. It is also known PGE2 promotes bone formation by modulating the balance between bone formation and resorption. But the underlying cellular mechanism r

8、emains unknown. In the present study, we set out to address this question by connecting the PGE2 treatment and mechanosensitivity of osteoblasts.</p><p>　　Methods: The intracellular calcium response was reco

9、rded by real-time calcium imaging. The modulation of PGE2 in calcium response was examined by PGE2 pre-treatment. The involvement of PKA was examined by its activator and inhibitor.</p><p>　　Results: dmPGE2

10、is able to promote the mechanosensitivity in MC3T3-E1 cells; and PKA was involved in this process.</p><p>　　Conclusion: Combined with our previous studies, we speculate when cells are treated with dmPGE2, ac

11、tivated PKA negatively regulates F-actin intensity, increases MSCC opening, and thus increases the mechanosensitivity in MC3T3-E1 cells.</p><p>　　Key words:mechanical loading; osteoblasts; mechanosensitivity

12、; cytoskeleton</p><p>　　Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China(11272366; 11172207; 10972243); Visiting Scholar Foundation of Key Laboratory of Biorheological Sc

13、ience and Technology (Chongqing University), Ministry of Education）（No. CQKLBST-2012-002)</p><p>　　Corresponding author:Jun Pan, Tel: 18983399552, E-mail: panj@cqu.edu.cn</p><p><b>　　引言<

14、;/b></p><p>　　骨組織的大小、形狀以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)與其所受到的力學(xué)刺激有著極為密切的關(guān)系。力學(xué)刺激能夠促使骨合成作用，抑制骨消融作用，從而達(dá)到增加骨密度的作用[1]。前列腺素E2（PGE2），作為一種多功能的調(diào)控分子，被普遍認(rèn)為在炎癥產(chǎn)生[2]，疼痛傳導(dǎo)[3]以及癌癥發(fā)展[4]中起重要調(diào)控作用。在骨組織中，PGE2能夠通過(guò)調(diào)控骨生成作用與骨消融作用之間的平衡而促進(jìn)骨密度的增加[5]。既往研究表明不

15、同濃度的PGE2通過(guò)分別激活蛋白激酶A（PKA）信號(hào)通路以及蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路調(diào)控靜態(tài)培養(yǎng)成骨細(xì)胞的分化與增值[6,7]。然而，PGE2與力學(xué)加載的交互作用對(duì)成骨細(xì)胞力學(xué)敏感性的調(diào)控尚不明確。闡明該機(jī)理能夠?yàn)榻獯餚GE2在骨組織中促合成作用提供重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。</p><p>　　成骨細(xì)胞，作為骨組織內(nèi)調(diào)控骨基質(zhì)生成的重要成員[8]，與骨細(xì)胞共同構(gòu)成了骨組織內(nèi)的三維力學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)[9,10]。力學(xué)刺激通

16、過(guò)激發(fā)成骨細(xì)胞內(nèi)的一系列生物學(xué)效應(yīng)，如胞內(nèi)鈣離子濃度的迅速變化（胞內(nèi)鈣離子信號(hào)）[11]，一氧化氮的釋放[12]，細(xì)胞骨架的重組，細(xì)胞硬度的增加[13]，Ⅱ型環(huán)氧化合酶表達(dá)的增加，前列腺素的釋放[14]，Ⅰ型膠原蛋白合成[15]來(lái)達(dá)到促進(jìn)成骨樣分化的效果。其中，最早產(chǎn)生的胞內(nèi)鈣離子信號(hào)作為第二信使參與了后續(xù)生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)控過(guò)程。因此被普遍認(rèn)為是細(xì)胞力學(xué)敏感性的指標(biāo)之一。</p><p>　　本研究中，我們通過(guò)使用

17、胞內(nèi)鈣離子作為力學(xué)敏感性的指標(biāo)，檢測(cè)PGE2對(duì)成骨細(xì)胞力學(xué)敏感性的調(diào)控作用。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p>　?。ㄒ唬⒅饕獙?shí)驗(yàn)試劑與儀器</p><p>　　主要實(shí)驗(yàn)試劑包括胎牛血清（Gibico）、α-MEM（Sigma）、青鏈霉素混合液（Sigma）、胰蛋白酶（Hyclone）、Ⅰ型膠原（Hyclone）

18、、16,16-二甲基前列腺素E2（dmPGE2，Cayman）、8-溴腺苷-3,5-環(huán)單磷酸鈉（8br-cAMP，Sigma）、蛋白激酶A多肽阻滯劑（PKI, Promega）、Fura-2 AM（Invitrogen）。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括注射器泵（Harvard，Apparatus）、鈣離子信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)（Intracellular Imaging）。</p><p><b>　　（二）、細(xì)胞培養(yǎng)<

19、/b></p><p>　　MC3T3-E1細(xì)胞購(gòu)買于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，使用含有10%胎牛血清以及1%青鏈霉素混合液的α-MEM，于37°C含有5%二氧化碳/95%空氣的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖至90%融合時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，3-10代的MC3T3-E1細(xì)胞被用于實(shí)驗(yàn)。</p><p>　?。ㄈ?、熒光染色，藥物處理以及細(xì)胞加載</p><p>

20、　　由于細(xì)胞水腫脹模型能夠較好的模擬力學(xué)刺激對(duì)細(xì)胞的作用，并且具有操作簡(jiǎn)單以及可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[16,17]。因此，本研究采用水腫脹加載對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行刺激并觀測(cè)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)。MC3T3-E1細(xì)胞按照初始密度（4×104 cell/ml）接種于經(jīng)過(guò)Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞增殖至80%融合時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞水腫脹加載，具體方法如下：使用Fura-2 AM（0.67mM）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行30 min的避光孵育（37°C）。

21、使用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗多余染料后，保留1 ml PBS并將培養(yǎng)皿移置熒光顯微鏡載物臺(tái)上，靜置30 min以消除染色過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的擾動(dòng)。隨后在靜態(tài)條件下對(duì)細(xì)胞分別進(jìn)行15 min的空白試劑（10 μl雙蒸水）、dmPGE2（10 nM）、8br-cAMP（100 μM）、dmPGE2 + PKI（10 μM）、或8br-cAMP + PKI處理。于藥物處理結(jié)束后，使用注射器泵緩慢加入1 ml的雙蒸水至培養(yǎng)皿中，并記錄相應(yīng)的鈣離子濃

22、度變化。</p><p><b>　　（四）、數(shù)據(jù)分析</b></p><p>　　本研究使用Excel對(duì)獲得的胞內(nèi)鈣離子濃度變化數(shù)據(jù)進(jìn)行處理：鈣離子響應(yīng)曲線中峰值除以基線平均值得到的倍數(shù)被定義為平均胞內(nèi)鈣離子信號(hào)強(qiáng)度（Mean Peak [Ca2+]i Response）；Mean Peak [Ca2+]i Response≥ 2時(shí)認(rèn)為細(xì)胞響應(yīng)；響應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量除以細(xì)

23、胞總數(shù)的百分比被定義為響應(yīng)率（Percentage of Responding Cells）；同一實(shí)驗(yàn)組平均鈣離子響應(yīng)曲線中加載初始點(diǎn)至峰值的線性擬合斜率被定義為響應(yīng)速率（Responding Rate）</p><p>　　實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)三次獨(dú)立的重復(fù)；數(shù)據(jù)表達(dá)方式為mean ± SD；使用卡方檢驗(yàn)對(duì)響應(yīng)率數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P < 0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異；使用One-way Anova以及bo

24、nferronia校正對(duì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P < 0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　?。ㄒ唬?、dmPGE2增加成骨細(xì)胞的力學(xué)敏感性</p><p>　　如圖1所示，水腫脹刺激促使空白處理組中MC3T3-E1細(xì)胞迅速產(chǎn)生胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)（圖1A）。而相對(duì)于空白組中的

25、細(xì)胞，15 min的dmPGE2預(yù)處理明顯提升了細(xì)胞中由同等強(qiáng)度水腫脹脹刺激誘導(dǎo)的鈣離子信號(hào)（圖1B）。</p><p>　　圖1. dmPGE2對(duì)成骨細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子信號(hào)的提升作用。</p><p>　?。╠mPGE2 Increases Intracellular Calcium Response in MC3T3-E1 Cells）</p><p>　　如表1所

26、示，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，得出具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：空白處理組（Untreated Cells）中，MC3T3E-1細(xì)胞的響應(yīng)率為61.2 ± 12.9%；胞內(nèi)鈣離子信號(hào)強(qiáng)度為4.07 ± 0.34；響應(yīng)速率為2.66 nM/second。而dmPGE2處理組中（dm PGE2 Pretreated cells），細(xì)胞的響應(yīng)率以及胞內(nèi)鈣離子信號(hào)強(qiáng)度分別顯著提升至86.5 ± 5.8%與5.4 ± 0.3

27、9（Pa? 0.05）；響應(yīng)速率提升至6.19 nM/second。提示dmPGE2能夠提升MC3T3-E1細(xì)胞的力學(xué)敏感性。</p><p>　　表1. dmPGE2對(duì)成骨細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子信號(hào)的提升作用。</p><p>　?。╠mPGE2 Increases IntracellularCalcium Response in MC3T3-E1 Cells）</p><p

28、>　　（二）、PKA信號(hào)通路在PGE2提升胞內(nèi)鈣離子信號(hào)過(guò)程中的參與作用</p><p>　　為了驗(yàn)證PKA信號(hào)通路在PGE2處理過(guò)程中的參與作用，我們分別使用PKA信號(hào)通路的激活劑8br-cAMP以及多肽阻斷劑PKI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理（圖2）。結(jié)果表明，8br-cAMP模擬了dmPGE2對(duì)細(xì)胞力學(xué)敏感性的提升作用（圖2A）。而PKI的加入在一定程度上抑制了dmPGE2對(duì)細(xì)胞力學(xué)敏感性的提升作用（圖2B）；同樣

29、，8br-cAMP對(duì)細(xì)胞力學(xué)敏感性的提升作用也同樣被PKI阻斷。</p><p>　　圖2. PKA信號(hào)通路在dmPGE2提升胞內(nèi)鈣離子信號(hào)過(guò)程中的參與作用。</p><p>　　（The Involvement of PKA Pathway in dmPGE2 Induced Intracellular Calcium Response Augment）</p><p

30、>　　如表2所示，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析我們得出具體數(shù)據(jù)：8br-cAMP處理組中（8br-cAMP Pretreated Cells），MC3T3E-1細(xì)胞的響應(yīng)率為81.1 ± 3.6%（比較空白組，Pa? 0.05）；胞內(nèi)鈣離子信號(hào)強(qiáng)度為5.31 ± 0.42（比較于空白組，Pa? 0.05）；響應(yīng)速率為3.30 nM/second。dmPGE2與PKI共處理組中（dmPGE2+PKI Pretreate

31、d Cells），相對(duì)于dmPGE2處理組，細(xì)胞的響應(yīng)率以及胞內(nèi)鈣離子信號(hào)強(qiáng)度分別顯著降低至69.7 ± 10.1%以及3.32 ± 0.20（比較dmPGE2處理組，Pb? 0.05）；響應(yīng)速率則降低至1.45 nM/second。8br-cAMP與PKI共處理組（8br-cAMP +PKI Pretreated Cells）中，相對(duì)于8br-cAMP處理組，細(xì)胞的響應(yīng)率以及胞內(nèi)鈣離子信號(hào)強(qiáng)度分別顯著降低至77.5

32、 ± 6.9%以及3.75 ± 0.36（比較8br-cAMP處理組，Pc? 0.05）響應(yīng)速率則降低至1.42 nM/second。提示PKA信號(hào)參與了dmPGE2對(duì)成骨</p><p>　　表2. PKA信號(hào)通路在dmPGE2提升胞內(nèi)鈣離子信號(hào)過(guò)程中的參與作用。</p><p>　?。═he Involvement of PKA Pathway in dmPGE2

33、Induced Intracellular Calcium Response Augment）</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　骨組織通過(guò)調(diào)控骨生成作用與骨消融作用之間的平衡來(lái)適應(yīng)其作出的力學(xué)環(huán)境。成骨細(xì)胞作為骨組織內(nèi)重要的力學(xué)感應(yīng)單元，在受到生理水平的力學(xué)刺激時(shí)，通過(guò)提高堿性磷酸酶活性[18]，增加Ⅰ型膠原分泌[15]以及胞外鈣沉積作用

34、[18]調(diào)控骨生成作用。力學(xué)刺激作用于成骨細(xì)胞表面，使得細(xì)胞產(chǎn)生微小形變，促使位于細(xì)胞膜表面的力學(xué)敏感型鈣離子通道（MSCC）的開(kāi)放[11,19]，引發(fā)胞外鈣離子的內(nèi)流以及細(xì)胞膜內(nèi)外電勢(shì)差，繼而激活同樣位于細(xì)胞膜表面的電壓敏感型鈣離子通道（VSCC）[20]。VSCC的開(kāi)放促使細(xì)胞向胞外釋放三磷酸腺苷（ATP）[21]，并由此引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣池中的鈣離子向細(xì)胞質(zhì)中的釋放[11,22]，共同構(gòu)成了胞內(nèi)鈣離子信號(hào)。胞內(nèi)鈣離子信號(hào)，作為細(xì)胞受到力

35、學(xué)刺激后首先產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，在力學(xué)信號(hào)向生物信號(hào)的翻譯過(guò)程中起到重要的傳導(dǎo)作用。由此可見(jiàn)，成骨細(xì)胞在受到力學(xué)刺激時(shí)的形變能力在一定程度上決定了細(xì)胞的力學(xué)敏感性。研究表明，甲狀旁腺素（PTH）,一種促進(jìn)成骨細(xì)胞骨樣分化的信號(hào)分子，能夠通過(guò)降低細(xì)胞骨架中微絲的強(qiáng)度來(lái)增加MSCC的開(kāi)放程度，繼而增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的力學(xué)敏感性[23]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)P</p><p>　　PKA信號(hào)通路廣泛參與了細(xì)胞力學(xué)敏感性的調(diào)控過(guò)

36、程。既往研究表明，PKA信號(hào)通路的激活能夠提升成骨細(xì)胞在受到流體剪應(yīng)力加載時(shí)產(chǎn)生的胞內(nèi)鈣離子信號(hào)[24]，并且在流體剪應(yīng)力引發(fā)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號(hào)通路的激活過(guò)程中起傳導(dǎo)作用[25]。本研究中，通過(guò)使用PKA信號(hào)通路的激活劑以及阻滯劑，我們發(fā)現(xiàn)PKA信號(hào)通路同樣參與了dmPGE2對(duì)成骨細(xì)胞力學(xué)敏感性的提升過(guò)程。有研究表明，PKA信號(hào)通路能夠通過(guò)調(diào)控微絲結(jié)構(gòu)繼而調(diào)控成骨細(xì)胞形態(tài)[26]。后續(xù)的研究表明，PKA信號(hào)通路通過(guò)抑制小

37、G蛋白超家族成員A（RhoA）活性降低微絲強(qiáng)度[27]。結(jié)合本研究未發(fā)表數(shù)據(jù)表明的PGE2對(duì)力學(xué)加載后成骨細(xì)胞微絲強(qiáng)度的降低作用，我們猜想PGE2或許通過(guò)類似于PTH的作用機(jī)理，即降低微絲強(qiáng)度，軟化成骨細(xì)胞，增加MSCC開(kāi)放的途徑來(lái)達(dá)到提升細(xì)胞力學(xué)敏感性的效果。</p><p>　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了PGE2能夠提升MC3T3-E1細(xì)胞的力學(xué)敏感性；PKA信號(hào)通路在此過(guò)程中起參與作用。本研究的結(jié)論為解答PGE

38、2在骨組織中促合成作用提供重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　本課題組感謝國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(11272366; 11172207; 10972243)；重慶大學(xué)“生物流變科學(xué)與技術(shù)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室訪問(wèn)學(xué)者基金資助（No. CQKLBST-2012-002）對(duì)本項(xiàng)目的資助。</p><p>

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