小鼠精原細胞增殖的激素和營養(yǎng)調(diào)控及其機理的研究.pdf

1、哺乳動物的生殖細胞發(fā)育是非常復(fù)雜的過程,受到多種激素、生長因子以及外源營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控。本實驗以體外培養(yǎng)的小鼠A型精原細胞為模型,研究表皮生長因子(epidermalgrowth factor,EGF)、前列腺素E1(prostaglandin E1,PGE1)及多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfatty acid,PUFA)對A型精原細胞體外增殖的作用并探討其機理,為哺乳動物生精細胞發(fā)育的激素和營養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù)。

2、>　　 1.前列腺素和表皮生長因子對小鼠A型精原細胞增殖的調(diào)控
　　 本實驗探討了PGE1對小鼠A型精原細胞增殖的作用及其機理。出生6天的ICR小鼠的睪丸組織用膠原酶分散成單個細胞,建立精原細胞-體細胞體外無血清共培養(yǎng)系統(tǒng)。C-kit免疫細胞化學(xué)鑒定表明所分離和培養(yǎng)的生殖細胞為A型精原細胞。增殖細胞核抗原免疫組織化學(xué)檢測表明添加了10μg/ml胰島素、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10-8mol/L亞硒酸鈉的DMEM培養(yǎng)液(ITS

3、培養(yǎng)液)可維持A型精原細胞的存活和增殖。該系統(tǒng)經(jīng)油紅O及3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)染色鑒定,發(fā)現(xiàn)Sertoli細胞經(jīng)油紅O染色后呈陽性,而3β-HSD染色陽性的Leydig細胞在體系中極少,說明本實驗所建立的培養(yǎng)系統(tǒng)系由A型精原細胞和Sertoli細胞組成。
　　 本實驗利用所建立的培養(yǎng)模型研究了PGE1和EGF對小鼠A型精原細胞增殖的影響,從而驗證該培養(yǎng)模型在外源因素對生殖細胞發(fā)育影響研究上的適用性。免疫細胞化學(xué)結(jié)

4、果表明EGF、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、前列腺素環(huán)氧化酶-1(cycloxygenase1,COX-1)和環(huán)氧化酶-2(cycloxygenase2,COX-2)主要表達于精原細胞。EGF(10-7～10-6mol/L)或PGE1(10-8～10-6mol/L)處理均可顯著促進精原細胞集落的形成。此外,PG受體拮抗劑SCl9220(10-6～10-5mol/L)可抑制

5、PGE1對精原細胞的促增殖作用,COX-1特異性抑制劑SC560(10-7～10-5mol/L)和COX-2特異性抑制劑NS398(10-7～10-5mol/L)均可顯著抑制EGF對精原細胞的促增殖作用。結(jié)果表明,EGF可通過促進局部PG的產(chǎn)生來刺激精原細胞的增殖。以上結(jié)果證明生殖細胞-體細胞共培養(yǎng)模型中的精原細胞對激素以及生長因子具有較好的反應(yīng)性,說明本實驗建立的培養(yǎng)模型是一種評價A型精原細胞體外增殖調(diào)控的合適模型,可用于哺乳動物精原

6、細胞發(fā)育調(diào)控機理的研究。
　　 2.多不飽和脂肪酸對小鼠A型精原細胞增殖和活性的影響
　　 本實驗探討了幾種PLJFA對小鼠A型精原細胞增殖和活性的影響,所選擇的PLJFA包括花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、亞油酸(linoleic acid,LA,n-6系列PUFA)和亞麻酸(α-linolenic acid,ALA,n-3系列PLJFA)。其中AA是一類順式PUFA,是動物細胞膜磷脂的重要組成部

7、分,也是PG合成的前體。本實驗利用無血清A型精原細胞體外培養(yǎng)模型探討了AA、LA和ALA對小鼠精原細胞發(fā)育及功能的影響。結(jié)果表明:單獨的AA在10-7mol/LLA在10-7～10-6mol/L濃度范圍內(nèi)對精原細胞集落形成有明顯的促進作用,而更高濃度的AA與LA則不同程度地抑制精原細胞集落的形成。AA與LA的促增殖作用能夠被PG生成阻斷劑n引哚美辛(Indomethacin,10-6～10-5mol/L)所抑制,提示AA與LA的促增殖作

8、用來自于PG的合成。而10-7～10-6mol/L濃度范圍ALA對精原細胞集落無明顯促增殖,更高濃度作用下則顯著抑制精原細胞集落的增殖。待細胞培養(yǎng)經(jīng)培養(yǎng)72 h后進行四甲偶氮唑藍比色法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide法,MTT法)測定細胞活性,發(fā)現(xiàn)AA(10-6～10-5mol/L)、LA(10-6～10-4 mol/L)以及ALA(10-6mo

9、l/L)能夠提高細胞活性,但當(dāng)AA達10-4 mol/L時,細胞活性下降。PKA、PKC免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),PUFA主要通過PKC信號途徑發(fā)揮作用。此外,通過對PUFA介入精原細胞培養(yǎng)體系的研究發(fā)現(xiàn),PUFA能夠增加細胞外基質(zhì)成分層粘連蛋白(1aminin,LN)和細胞間連接蛋白(connexin,Cx43)的表達。上述結(jié)果表明AA與LA的促增殖作用來自于PG的合成,合適濃度的PUFA通過PKC信號通路增強了細胞活性,并通過促進L

10、N和細胞間Cx43的合成以調(diào)控細胞的功能。
　　 3.小結(jié)
　　 本實驗利用6日齡小鼠睪丸內(nèi)精原細胞與Sertoli細胞共培養(yǎng)模型,探討了PGE1、EGF以及幾種PUFA對小鼠A型精原細胞增殖及活性的影響。結(jié)果表明EGF和PGE1均可促進精原細胞集落的形成,且PG受體拮抗劑SC19220可抑制PGE1對精原細胞的促增殖作用,COX-1抑制劑SC560和COX-2抑制劑NS398能抑制EGF促進精原細胞增殖的作用,揭示EG

11、F可通過促進局部PG的產(chǎn)生而刺激精原細胞的增殖。并且,AA與LA在一定濃度范圍內(nèi)對精原細胞有明顯的促增殖作用,其機理可能是通過促進PG的前體供給,對PG的產(chǎn)生有了一定的促進作用,而更高濃度的AA與LA則抑制精原細胞的增殖。ALA對糯原細胞無明顯促增殖作用。MTT法測定細胞活性發(fā)現(xiàn),AA與LA主要通過PKC信號途徑增強細胞的活性。此外,AA及ALA能夠增加LN和細胞間Cx43的表達,提示AA及ALA通過PKC信號通路增強了細胞活性,并通過