反向液相色譜的工作原理

1、誰能告訴我一下反向液相色譜的工作原理嗎？它與正向的有什么區(qū)別嗎？高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。1液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數用于非離子型化合物，離子

2、型化合物易產生拖尾。常用于分離同分異構體。2液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，

3、現在已很少采用?，F在多采用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜法一般用

4、非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統(tǒng)計，它占整個HPLC應用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為

5、2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH1.5~10范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法反相色譜法固定相極性高～中中～低流動相極性低～中中～高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出根據分離機理—分配色譜—樣品組分的分配系數不同—吸附色譜—樣品組分對固定相表面吸附力不同—體積排阻色譜—利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開—離子交換色譜—不同離子與固定相商相

6、反電荷間的作用力大小不同根據極性—流動相極性＞固定相極性反相色譜—流動相極性＜固定相極性正相色譜氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學性質穩(wěn)定的有機化合物，而HPLC則適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質，如揮發(fā)性差、極性強、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質。所以，HPLC的應用范圍已經遠遠超過氣相色譜。一、吸附色譜（adsptionchromatography）又叫液固色譜法：流動相是液體，固定相是固體。分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附

7、劑是多孔性微粒物質表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產生保留時間不同和實現分離。固定相：固定相通常是強極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑?；钚怨枘z最常用。流動相：弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷甲醇、乙酸乙酯乙腈等。應用：對于極性，結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法，如農藥異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離

8、。缺點是容易產生不對稱峰和拖尾現象。二、分配色譜原理：固定液機械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進入兩相分配而實現分離。固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。根據極性不同分類：正相分配色譜—固定相載體上涂布的是極性固定液；流動相是非極性溶劑；可分立極性較強的水溶性樣品；弱極性組分先洗脫出來。反相分配色譜—固定相載體上涂布的是非極性或弱極性固定液；流動相是極性