固定化酶

1、Enzyme Engineering酶工程,第三章 固定化酶,第一節(jié) 概述第二節(jié) 固定化酶的性質及其影響因素第三節(jié) 固定化酶的制備第四節(jié) 固定化細胞第五節(jié) 固定化輔酶和原生質體第六節(jié) 酶反應器和固定化酶（細胞）的應用,第一節(jié) 概述,圖6-1 生物催化劑作用方式示意,固定化酶的發(fā)展史,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性載體,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技術,第一節(jié) 概述,二． 固定化酶的優(yōu)缺點

2、 多次使用 可以裝塔連續(xù)反應優(yōu)點： 純化簡單 提高產物質量 應用范圍廣缺點： 首次投入成本高 大分子底物較困難,,,第一節(jié)結束,點擊返回,第二節(jié) 固定化酶的性質及其影響因素,一． 影響固定化酶性質的因素二． 固定化后酶性質的變化三． 評價固定化酶的指標,一． 影響固定化酶性質的因素,1

3、． 酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結構和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。,一． 影響固定化酶性質的因素,2． 載體的影響（1） 分配效應（2） 空間障礙效應（3） 擴散限制效應3. 固定化方法的影響,二．固定化后酶性質的變化,1． 固定化對酶活性的影響：酶活性下降，反應速度下降原因：酶結構的變化 空間位阻,二． 固定化酶的性質,2． 固定化對酶穩(wěn)定性的影響（1） 操作穩(wěn)定性提高

4、（2） 貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。 (3 ) 對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。 (4 ) 對分解酶的穩(wěn)定性提高。（5） 對變性劑的耐受力升高,2 ．固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：,a. 固定化后酶分子與載體多點連接。b. 酶活力的釋放是緩慢的。c. 抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。,3． pH的變化,PH對酶活性的影響：（1） 改變酶的空間構象（2）影響酶的催化基團的解離（3）影響酶的結合基團的

5、解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結合或結合后不能生成產物。,pH對固定化酶的影響,1） 載體帶負電荷，pH向堿性方向移動。 微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。,3． pH的變化,載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。（2）產物性質對體系pH的影響催化反應的產物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低,4． 最適溫度變化,一般與游離酶差不多，但有些會

6、有較明顯的變化。5． 底物特異性變化作用于低分子底物的酶 特異性沒有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特異性往往會變化。,,,6． 米氏常數(shù)Km的變化，Km值隨載體性質變化,（1） 載體與底物帶相同電荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，Km'<Km,,三． 評價固定化酶的指標：,1． 酶活定義（IU)：在特定條件下

7、，每一分鐘催化一個微摩爾底物轉化為產物的酶量定義為1個酶活單位。1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min =6*106IU2. 酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位,三． 評價固定化酶的指標：,1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。 或：單位面積（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、

8、酶板）。2. 操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標。 連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（t1/2）,三． 評價固定化酶的指標：,3. 4. 或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分數(shù)。5.相對酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力,四 固定化酶的活力測定方法介紹,1. 振蕩測定法：2. 酶柱測定法：,四 固定化酶的活力測定方法介紹,3. 連續(xù)測定法利用連續(xù)

9、分光光度法等測定方法可以對固定化酶反應液進行連續(xù)測定，從而測定固定化酶的酶活力。,第二節(jié)固定化酶的性質及其影響因素提要,影響固定化酶性質的因素固定化酶的性質評價固定化酶的指標,酶本身的變化載體的影響,固定化對酶活性的影響固定化對酶穩(wěn)定性的影響最適pH的變化最適溫度變化底物特異性與游離酶不同米氏常數(shù)Km的變化,評價指標活力測定方法,,,,,第二節(jié)結束,點擊返回,第三節(jié) 固定化酶的制備,一． 一般方法及特點二．

10、 酶的固定化方法,一． 一般方法及特點,關鍵在于選擇適當?shù)墓潭ɑ椒ê捅匾妮d體以及穩(wěn)定性研究、改進。1． 四大類方法：吸附法（包括電吸附法）結合法（無機多孔材料）交聯(lián)法（雙功能試劑） 包埋法（微膠囊法）,各類固定化方法的特點比較:,2． 選擇方法依據(jù)：,（1） 酶的性質（2） 載體的性質（3） 制備方法的選擇,3． 固定化后酶的考察項目：,（1） 測定固定化酶的活力，以確定固定化過程的活力回收率。（2） 考察

11、固定化酶穩(wěn)定性（ 2） 考察固定化酶最適反應條件,二． 酶的固定化方法,（一） 吸附法（二）結合法（三）交聯(lián)法（四） 包埋法（entrapping method）,（一） 吸附法,1． 物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。 選擇載體的原則 （1）要有巨大的比表面積 （2） 要有活潑的表面（3） 便于裝柱進行連續(xù)反應。,（二）結合法,1 離子鍵結合法2 共價鍵結合法☆,1 離子鍵結合法

12、,概念常用載體:DEAE-纖維素， DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強度、溫度,2 共價鍵結合法,（1）概念（2）可以形成共價鍵的基團： 游離氨基， 游離羧基， 巰基， 咪唑基， 酚基， 羥基， 甲硫基， 吲哚基，二硫鍵（3）常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體,共價鍵結合法制備固定化酶的“通式”,首先載體上引進活潑基團

13、 關鍵 然后活化該活潑基團 最后此活潑基團再與酶分子上某一基團形成共價鍵,,（4）載體活化的方法,A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應法D．硅烷化法E．溴化氰法,A．重氮法,反應示意式如下,A．重氮法,目前在我們國內用的

14、較多的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等該方法需要載體具有芳香族氨基,A．重氮法,反應式及原理,B 疊氮法,例用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下：⑴ 酯化⑵ 肼解⑶ 疊氮化(4) 偶聯(lián),B 疊氮法,對含有羧機基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后于酶偶聯(lián),C．烷基化反應法,含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進行活化，形成含有鹵素基

15、團的活化載體。,D．硅烷化法,多孔玻璃特點：①機械強度好，表面積大。②耐有機溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。,D．硅烷化法,一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。,D．硅烷化法,D．硅烷化法,D．硅烷化法,E ．溴化氰法,本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結構）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。,

16、E ．溴化氰法,（三）交聯(lián)法,借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結構的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。,（三）交聯(lián)法常用試劑,常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、N，N’乙烯馬來亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。應用最廣泛的是戊二醛，它兩個醛基都可以與酶或蛋白質的游離氨基形成席夫堿(shiff),（三）交聯(lián)法的形式,交聯(lián)法有2種形式：酶直接交聯(lián)法

17、 酶輔助蛋白交聯(lián)雙重固定法 （1） 吸附交聯(lián)法（2） 交聯(lián)包埋法,,酶直接交聯(lián)法,在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強度、溫度和反應時間之間的平衡。,酶輔助蛋白交聯(lián),為避免分子內交聯(lián)和在交聯(lián)過程中因化學修飾而引起酶失活，可使用第二個"載體"蛋白質（即輔助蛋白質，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質濃度，使酶與惰性蛋白質共交聯(lián)。,（1） 吸附交聯(lián)

18、法,先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。,（2）交聯(lián)包埋法,把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結成顆粒很細的集合體，然后用高分子或多糖一類物質進行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細的缺點，同時制得的固定化酶穩(wěn)定性好。,（四） 包埋法（entrapping method）,定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。,（

19、四） 包埋法,包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型1．網(wǎng)格型2．微囊型,1．網(wǎng)格型,(1) 概念 將酶或含酶菌體包埋在凝膠細微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法,2．微囊型包埋法,是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。,微囊化法制備固定化酶有兩種方法,① 界面沉淀法②界面聚合法,① 界面沉淀法,這是一種簡單的物理法，它是

20、利用某些高聚物在水相和有機相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。,②界面聚合法,是用化學手段制備微囊的方法。利用油水界面上發(fā)生聚合反應形成聚合體而將酶包裹起來。,②界面聚合法,固定化酶方法研究熱點,1 熱處理法： 2 結晶法： 3 分散法：,第三節(jié)提要,一般方法及特點酶的固定化方法,,吸附法結合法交聯(lián)法包埋法,,,第三節(jié)結束,點擊返回,第三章 固定化酶,第一節(jié) 概述第二節(jié) 固定化酶的性質及其影響因素第三節(jié) 固定

21、化酶的制備第四節(jié) 固定化細胞第五節(jié) 固定化輔酶和原生質體第六節(jié) 酶反應器和固定化酶（細胞）的應用,第四節(jié) 微生物、植物和動物細胞固定化,細胞特性比較,固定化細胞的特點,類型：微生物細胞、植物細胞、動物細胞生理狀態(tài)：死細胞（完整細胞、細胞碎片、細胞器） 活細胞（增殖細胞、靜止細胞、完整細胞）形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。 最多使用：顆粒狀珠體使用周期：理論上

22、講，固定化增殖細胞保持了細胞原有的全部活性， 只要載體不解體，不污染就可以長期使用。,概念：,固定在載體上并在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞稱為固定化細胞.該細胞能進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細胞或固定化增殖細胞。,細胞固定化方法,吸附法包埋法,,酶和細胞固定化示意圖,吸附法,它主要通過載體與細胞間的靜電引力，即細胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細胞固定在載

23、體上的。,影響吸附法的主要因素,（1）Z-電位： Z-電位能近似地代表表面電荷密度的大?。?）細胞的性質和細胞壁的組成：細胞壁的電荷性質（3）載體的性質：特別是玻璃、陶瓷等無機材料,包埋固定法,包理法是在細胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點是能較好的保持細胞內多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細胞那樣進行產物的發(fā)酵生產。,包埋法分類,常用載體：瓊脂、海藻酸鈣、角叉

24、菜膠、明膠、聚丙烯酰胺常用凝膠包埋法,舉例海藻酸鈣包埋法,基本原理是：稱取一定量的海藻酸鈉配成水溶液，經殺菌冷卻后，與一定體積的細胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器或滴管將冷懸液滴入一定濃度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球狀固定化細胞,通過改變載體溶液參數(shù)包埋細胞,改變載體溶液、操作溫度、鹽濃度、pH值和溶劑等參數(shù)時，亦可使其轉變?yōu)槟z狀態(tài)，將細胞包埋其中。,研究熱點——光交聯(lián)樹脂包埋法,例：相對分子量為1000-3000

25、的光交聯(lián)聚氨酯預聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃，然后與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得,固定化細胞的目的,微生物菌體：不需多次培養(yǎng)、擴大，從而縮短了發(fā)酵生產周期植物細胞動物細胞,第四節(jié)固定化細胞提要,特點方法目的,,第四節(jié)結束,點擊返回,第五節(jié) 固定化原生質體和輔酶,一 原生質體的制備二 固定化三 舉例四 輔酶固定化,一 原生質體的制備,將對數(shù)

26、生長期的細胞收集——懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中——加入水解酶——分離——得到原生質體,,二 原生質體固定化的方法,將原生質替制備好后，把離心收集到的原生質體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質體。,四 輔酶固定化,1 原因有機輔因子中具有某些特殊的化學基團，參與酶的催化反應有機輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生有機輔因子價格昂貴——工業(yè)上應用全酶的關

27、鍵是有機輔因子的保留和再生,輔酶固定化的方法：,2 固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價偶聯(lián)，或將其進行適當?shù)幕瘜W修飾后固定在超濾器中。3 輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。,輔酶的固定化,輔酶的固定化,輔酶固定化的形式：,第五節(jié) 固定化原生質體和輔酶的固定化,原生質體輔酶固定化,方法固定化要點,原因方法形式,,,,第五節(jié)結束,點擊返回,第六節(jié) 酶反應器和固定化酶（細胞

28、）的應用,酶反應器介紹反應器選擇的依據(jù)反應器和酶穩(wěn)定性固定化酶和細胞的應用（工農業(yè)、醫(yī)藥、分析化學、酶電極、親和色譜、環(huán)境保護、能源開發(fā)、基礎理論研究）,生物催化反應器工程,通過反應器型式、操作方式的改變能否使生物催化反應效率最大化？將反應與傳質緊密相關,一．酶反應器。,1． 分批攪拌反應器。2． 連續(xù)流攪拌桶反應器。3． 連續(xù)攪拌桶-超濾反應器4． 填充床反應器5． 循環(huán)反應器6． 流化床反應器,1． 分批攪拌反應

29、器,反應器結構簡單，不需要特殊裝置，適與小規(guī)模試驗,,,,,2． 連續(xù)流攪拌桶反應器,連續(xù)攪拌釜式反應器,3． 連續(xù)攪拌桶-超濾反應器,,,,,,,,,酶循環(huán),,,,,,4． 填充床反應器,旋轉填充床,5． 循環(huán)反應器,高效內循環(huán)生物反應器（HCR）,6． 流化床反應器,與連續(xù)流攪拌桶式反應器類似，是讓適量的顆粒狀酶懸浮于反應床中，不用攪拌器，而是底物向上流過固定酶床，因此流速要適當控制。,反應器選擇,酶的形式：底物的物理性質：酶反

30、應動力學酶的穩(wěn)定性操作要求、應用和可塑性成本,反應器和酶的穩(wěn)定性,反應器中酶催化活性損失的原因：酶本身失效酶從載體上脫落載體肢解擴散限制效應,生物催化反應－分離耦合反應器,Diagram of the enzymatic synthesis of cefaclor with in situ product removal. (1) Complexation reactor, (2) enzymatic reaction re

31、actor, (3) peristaltic pump, (4) sintered-glass (G2), (5) mechanical stirrer.,反應－分離耦合反應器成功實現(xiàn)產物在線分離,青霉素?；干锎呋铣深^孢克羅,產物在線分離策略實現(xiàn)頭孢克羅半連續(xù)制備,Journal of Molecular Catalysis, 17(2):81-87, 2003. Biotechnology Letters, 2003, 25

32、(14): 1195-1198. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic,2003,26 (1-2):99-104. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2004, 79:480-485.,減壓式反應器用于生物催化反應中易揮發(fā)產物的在線去除,Wei Dongzhi*, Yu ying, Biocatalysis and Biotransf

33、ormation, 2003,21(3)135-139.,生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯,減壓式反應器用,常規(guī)反應器用,二．固定化酶（細胞）的應用,1. 固定化酶（細胞）在工農業(yè)生產上的應用2． 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應用3． 固定化酶在分析化學中應用4． 固定化酶和親和色譜5． 固定化酶與環(huán)境保護6． 新能源開發(fā)中的應用7． 固定化酶在基礎理論研究中應用,1． 固定化酶（細胞）在工農業(yè)生產上的應用,葡萄糖異構酶——世界

34、上生產規(guī)模最大的一種固定化酶。利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產低乳糖奶固定化酵母細胞等微生物可用于生產各種酒類熱點：固定化原生質體的應用,2． 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應用,例1固定化青霉素?；?，只要改變pH值等條件，就可以生成不同的產物。,青霉素酰化酶催化合成頭孢類抗生素,7-ACA as nucleus,青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素,7-ACCA or 7-ADCA as nucleus,酶促合成頭孢類抗生素,-- Reve

35、rsible reaction -- Hydrolysis of substrate or product by biocatalyst -- Difficulty of separation of product from reactants,固定化酶在醫(yī)藥治療上的應用,例2：制造人工腎利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的體外循環(huán)裝置，大大提高了療效。,3．固定化酶在分析化學中應用,酶柱和酶管，可與分光光度計、熒光計或電量計

36、結合，形成酶電極，進行某些物質的自動分析。,酶電極,特點：快速、方便、靈敏、精確范圍：糖類、抗生素、氨基酸、甾體化合物、有機酸、脂粉、醇類、胺類以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等要求：酶必須有較強的專一性，并且要有一定的純度。,研究新方向-微生物傳感器,呼吸活性測定型：電極活性測定型的微生物傳感器,酶電極,4． 固定化酶和親和色譜,親和技術的基礎：是生物活性化合物生物特異信息的綜合。利用了生命現(xiàn)象中生物分子間特有的高親和力、高專一

37、性，可逆結合而設計的純化方法是唯一能夠體現(xiàn)待分離物質間生物學功能差異的分離方法,5． 固定化酶與環(huán)境保護,一：環(huán)境監(jiān)測二：污染物處理。,6． 新能源開發(fā)中的應用,H2是重要的能源物質，雖然有許多微生物可以產生H2，但產氫系統(tǒng)不穩(wěn)定。有人利用固定化丁酸梭菌連續(xù)產氫，穩(wěn)定性比天然細胞好。 將植物的葉綠體中的鐵氧還原蛋白氧化酶系統(tǒng)用膠原膜包被，可用于水的光介產生氫氣和氧氣,7． 固定化酶在基礎理論研究中應用,闡明酶反應機理揭示酶原激活

38、機理,酶亞基性質的研究,,研究蛋白質-核酸分子結構,連續(xù)的固定化酶柱進行DNA序列分析原理：是測定DNA聚合時，以摻入dNTP同時釋放的焦磷酸判斷是否發(fā)生了聚合反應，進而確定摻入的是哪種核苷酸從而推導出序列——該系統(tǒng)由連續(xù)的6個固定化酶柱組成焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、ATP磷酸化酶，熒光酶柱,第六節(jié)結束,酶反應器應用,分批攪拌反應器。連續(xù)流攪拌桶反應器。連續(xù)攪拌桶-超濾反應器填充床反應器循環(huán)反應器