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1、第三單元免疫凝集類實驗,,驗證實驗一 直接凝集實驗,,顆粒性抗原與相應抗體直接反應，在適當電解質參與下出現(xiàn)的肉眼可見的凝集現(xiàn)象。常用的試驗方法有玻片凝集法和試管凝集法。本實驗以試管法凝集試驗——肥大試驗（Widal test）驗證凝集反應及其特點。,Widal test原理 將已知的顆粒性抗原（傷寒沙門菌）定量加入到系列倍比稀釋的待測血清中，根據(jù)各血清稀釋度凝集情況，測定血清中有無相應抗體及其相對含量。,

2、實驗器材和材料器械 試管、吸管、恒溫水浴箱等試劑 抗體 待測傷寒沙門菌免疫血清、抗原 傷寒沙門菌診斷菌液（7×108/ml)、生理鹽水,實驗方法（Widal test） 取試管7支，依次編號并做好標記。每支試管中加生理鹽水0.5ml。倍比稀釋血清： 取1∶20稀釋的待測血清0.5ml加入到第1管，混勻后吸取0.5ml加入到第2管，如此連續(xù)稀釋至第6管，混勻后吸取0.5ml棄去

3、；第7管不加血清作為陰性對照。 加診斷菌液： 每管加傷寒沙門菌H或O診斷菌液0.5ml，此時各管血清最終稀釋度依次為1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560搖勻后置37℃水浴2～4h，取出觀察結果或放室溫過夜，次日觀察結果。,試管凝集法操作程序,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0.5,0.5,,,0.5,,,,,,,,0.5,0.5,棄掉0.5,,,

4、,,,,結果,1 2 3 4 5 6 7,菌液,試管凝集試驗原理,結果判斷實驗結果將試管置于有良好光源和黑色背景下，觀察管底凝集物的范圍和上清液的濁度，記錄凝集程度，判斷凝集效價用++++、+++、++、+、-等符號記錄凝集效價。對照管：應無凝集現(xiàn)象試驗管：“++++”：上清液澄清，細菌全部凝集，凝集塊全部沉于管底

5、 “+++”：上清液稍混濁，細菌大部分凝集并沉于管底 “++”：上清液較混濁，約50%的細菌凝集并沉于管底 “+”：上清液混濁，僅少量細菌凝集 “-”：不凝集，液體濁度與對照管相同血清抗體效價：試驗管出現(xiàn)“++”以上的凝集現(xiàn)象即可判斷為陽性；以出現(xiàn)“++”凝集的最高血清

6、稀釋度為該待測血清的抗體效價。,注意事項凝集反應只有在抗原抗體比例適當時，才能出現(xiàn)肉眼可見的反應 一般情況下，隨著血清濃度的逐漸稀釋，凝集反應越來越弱，但在抗體濃度過高時，反而無凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，此為前帶現(xiàn)象，出現(xiàn)該情況時，須加大抗體稀釋倍數(shù)重新試驗。直接凝集試驗也可以用玻片法 以鑒定傷寒沙門菌為例：取潔凈載玻片2張，在玻片的左上角分別標明“1”、“2”； 加入已知抗體（傷寒沙門菌診斷血清）和待測菌液（傷寒沙門菌或其他細菌

7、）。,玻片凝集試驗鑒定傷寒沙門菌,?,,,,玻片凝集試驗(slide agglutination test),顆粒性抗原與相應抗體直接結合,,出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象,,在玻片上,,Y,Y,,+,?,？,,Y,+,?,,,,將載玻片置黑色背景上觀察。 在診斷血清中，混懸液由混濁變澄清并出凝集物，則為陽性結果；混懸液仍為勻混濁的乳狀液，則為陰性結果。肉眼觀察不夠清晰者，可在低倍鏡下觀察。,結果分析,實驗討論肥大試驗是一種經

8、典的半定量試管凝集試驗。在臨床上主要用已知的傷寒沙門菌O或H抗原檢測血清中有無相應的特異性抗體及其效價，以協(xié)助診斷傷寒病或供流行病學調查。 凝集反應只有在抗原抗體比例適當時，才能出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 臨床上開展的外斐反應是利用與立克次體有共同耐熱性多糖抗原的變形桿菌OX19、OX2、OXk菌株代替立克次體作為已知抗原，與患者血清進行凝集試驗，以輔助診斷斑疹傷寒、恙蟲病等立克次體疾病。 現(xiàn)有OX19、OX2、O

9、Xk三種診斷菌液和待測血清，請寫出利用試管凝集法進行的外斐試驗的操作步驟。,思考題 為什么臨床上不直接利用立克次體作為已知抗原進行血清學診斷呢？,驗證實驗二 間接凝集實驗,,間接凝集實驗（indirect Agglutination Test)將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關、大小均勻的惰性載體顆粒表面，使其成為致敏載體，然后再與相應抗體（或抗原）結合，在適當電解質存在的條件下，載體顆粒被動地發(fā)生

10、凝集，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 以膠乳凝集試驗檢測類風濕因子（rheumatoid factor,RF）為例驗證間接凝集實驗的原理和特點,實驗原理 類風濕因子（RF）是一種抗變性IgG的自身抗體，具有與人或動物變性IgG結合的特點。將處理過的人IgG與聚苯乙烯膠乳顆粒結合成致敏顆粒，當待測血清中含有RF時，則與致敏顆粒上變性的IgG發(fā)生反應，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。,,,,膠乳顆粒,人IgG,致敏,致敏膠乳,NS,凝集顆粒,待

11、測RF,實驗器材 器械 黑色方格反應板、毛細滴管、試管、試管架、吸耳球、恒溫水浴箱等試劑 人IgG致敏膠乳試劑（市售類風濕因子檢測試劑）類風濕因子陽性血清和陰性血清：臨床標本篩選獲得 待測血清,實驗方法 待測血清、陽性血清、陰性血清分別用生理鹽水作1∶20稀釋。在黑色方格反應板上取3個格，用毛細滴管分別滴加稀釋待測血清、陽性血清、陰性血清各1滴，然后每格加入人IgG致敏膠乳

12、試劑1滴。連續(xù)輕輕搖動反應板，2～3分鐘后觀察結果。,結果判斷 若膠乳顆粒凝集且液體澄清者為陽性反應膠乳顆粒不凝集仍保持均勻膠乳狀者為陰性反應,注意事項試劑應4℃保存，嚴禁凍結，用時搖勻；所有試驗器皿和反應板均應洗凈、干燥；若陰性對照出現(xiàn)凝集，則表示致敏乳膠試劑有質量問題，不能使用。,實驗結果分析和討論膠乳凝集試驗方法簡便、快速，但易發(fā)生非特異性凝集反應，試分析如何判定實驗的非特異性凝集反應。判斷凝集或凝集程

13、度除目測外，是否還有其他方法？,驗證實驗三 間接凝集抑制實驗,,概 念間接凝集抑制試驗（indirect agglutination inhibition test）是以抗原致敏的載體及相應抗體作為診斷試劑，用于檢測標本中是否含有與致敏抗原相同的抗原的試驗。檢測時先將抗體試劑與待測標本混合，再加入抗原致敏的載體。若標本中沒有與抗體試劑相對應的抗原，則抗體試劑與隨后加入的致敏載體上的抗原結合而出現(xiàn)凝集；若標本中存在與抗體試劑相對應的

14、抗原，抗體先與之結合，隨后加入的致敏載體上的抗原則無抗體結合，凝集反應被抑制。本實驗以檢測尿絨毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠免疫診斷試驗為例進行膠乳凝集抑制現(xiàn)象的觀察和驗證。,實驗原理 孕婦尿液中含有HCG，正常人尿中無HCG。當向孕婦尿中加入一定量抗HCG抗體時，尿HCG即與抗HCG發(fā)生抗原抗體反應，此時，再加入膠乳抗原（吸附有HCG的聚苯乙烯膠乳顆粒），因抗體被消耗，故不能發(fā)生凝集，即凝集被抑制，為凝集抑制試驗

15、陽性；反之，若待檢尿中無HCG（非妊娠尿），則加入的抗HCG抗體未被結合和消耗，可與隨后加入的乳膠抗原發(fā)生反應，出現(xiàn)肉眼可見的細小顆粒，即凝集未被抑制，為凝集抑制試驗陰性。,待測尿液(含HCG),抗HCG,特異結合,抗原抗體復合物,NS,,＋,,,致敏膠乳,無凝集顆粒為陽性,待測尿液(無HCG),抗HCG,無結合,NS,,＋,,致敏膠乳,有凝集顆粒為陰性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,實驗器材和材料器械黑色方格

16、反應板、毛細滴管試劑與標本 膠乳抗原（HCG致敏的膠乳顆粒）、抗HCG抗體（商品化） 孕婦尿液、正常人尿液、待測尿液。 生理鹽水,實驗方法在黑色方格反應板上取3個格，用毛細滴管分別加待測尿液、孕婦尿液、正常人尿液（或生理鹽水）1滴，然后每格加抗HCG抗體1滴，輕輕搖動1～2min。于上述3格中各滴加膠乳抗原1滴，輕輕搖動2～3min后觀察結果。,結果判斷,如肉眼觀察結果不清楚，可用顯微鏡在低倍鏡下

17、觀察,注意事項待測尿液宜采用晨尿，不能及時檢測檢測的標本應保存于2~8℃，不能使用嚴重蛋白尿、血尿、菌尿標本；試劑應4℃保存，切勿凍存。使用前使試劑接近室溫并搖勻；應同時設置陽性、陰性對照，以排除非特異性凝集；所加液滴應大小一致；結果應在強光下觀察，觀察時應置黑色背景下或稍傾斜反應板。,實驗結果分析和討論妊娠免疫診斷試驗是臨床常用的經典膠乳凝集抑制試驗，操作簡便、快速、特異性強，停經35～40天以上的孕婦可測得陽性結果。

18、需注意的是，絨毛膜上皮癌、葡萄胎及睪丸畸胎瘤病人尿中HCG含量遠較正常妊娠尿液為高，將尿液作1∶200稀釋后仍可呈陽性反應。待測尿液以晨尿為好。測試時應注意標本及各診斷試劑加入的順序，并設立陽性和陰性對照。試分析若隨意變更加樣順序，如先加標本、再加膠乳抗原，最后加抗HCG或先加膠乳抗原、再加抗HCG，最后加標本，結果如何？ 凝集抑制試驗可用于確證呈陽性反應的間接凝集實驗是否是非特異凝集反應，試討論如何進行該項實驗？,不完全

19、抗體檢測的實驗設計（設計性實驗）,,實驗目的 采用紅細胞作為凝集試驗的抗原，創(chuàng)造條件設法使相鄰的紅細胞靠近、聚攏、凝集從而達到對紅細胞不完全抗體的檢測目的。,問題背景資料 抗體與相應抗原結合后，在適宜的介質參與下可出現(xiàn)可見的抗原抗體反應。但有些分子較小的7S的IgG類抗體，體積小，長度短，在適宜介質中與相應抗原結合后不出現(xiàn)可見反應，這種抗體稱為不完全抗體，如抗紅細胞Rh抗原的抗體等，這種抗紅細胞不完全抗體的存在是引

20、起輸血不良反應的主要原因之一，有必要設計檢測不完全抗體，特別是針對紅細胞抗原不完全抗體的的檢測方法。,實驗設計的策略不完全抗體只含有一個抗原結合位點， 能與相應抗原結合，但不產生可見反應，因此也稱單價抗體 ?？辜t細胞不完全抗體與紅細胞結合后，因抗體分子小，不能有效地連接紅細胞，僅使紅細胞處于致敏狀態(tài)，而不出現(xiàn)可見的凝集反應。在實驗設計時，基本的思路是采用紅細胞作為凝集試驗的抗原，創(chuàng)造條件設法使相鄰的紅細胞靠近、聚攏

21、、凝集從而達到對紅細胞不完全抗體的檢測目的。,實驗方案討論凝集反應可分為哪兩個階段？其中可見反應階段主要受哪些因素影響？可否根據(jù)影響因素，通過設置低離子強度介質以降低紅細胞的Zeta電位和加入高價陽離子鹽類以中和紅細胞表面負電荷等來促使紅細胞凝集？此時又如何判斷是特異性凝集還是非特異性凝集？紅細胞表面的不完全抗體是IgG，即免疫球蛋白，此時若在反應體系中加入抗人球蛋白，會出現(xiàn)何結果？抗人球蛋白如何制備？如何檢測血清中未與紅細

22、胞結合和與紅細胞結合的不完全抗體？,免疫凝集分析系統(tǒng)——全自動血型分析系統(tǒng)（臨床見習）,,基本原理全自動血型分析系統(tǒng)采用柱凝集血型診斷系統(tǒng)試劑卡技術和數(shù)字圖像處理技術自動實現(xiàn)人血樣本的體外免疫血液檢測。ABO/Rh 血型診斷試劑卡是基于獨特的柱凝集技術原理而設計的。該卡是在一種特制的塑料卡上設計有6個微柱，每個微柱中均裝有一定數(shù)量具有分子篩作用的玻璃珠，并分別預置了抗A、抗B、抗D特異性抗體的試劑。當受檢者紅細胞進入測試柱與相

23、應抗體反應并經低速和高速雙相離心后，發(fā)生凝集的紅細胞被阻滯在玻璃珠的上層（陽性），而未凝集的游離紅細胞則會在離心力的作用下通過玻璃珠介質之間的間隙沉積于柱的底部（陰性）。由此可將凝集紅細胞與未凝集紅細胞分開，達到鑒定ABO/Rh血型的目的。,見習內容與要點,全自動血型分析系統(tǒng),了解該分析系統(tǒng)的整體結構和工作性能掌握人血樣本體外免疫血液自動檢測的基本原理熟悉整個操作流程,本實驗以AutoVue＠全自動血型分析系統(tǒng)用于人紅細胞ABO/R

24、h血型的正定型為例進行介紹整體結構,,,計算機,打印機,不間斷電源(可選),儲液桶,試劑卡,AutoVue Innova,樣本的識別與加樣紅細胞混懸與制備試劑的識別與分配孵育離心結果的閱讀與解釋試劑卡的保存與移動,AutoVue Innova 的功能,AutoVue Innova 的檢測菜單,ABO/Rh 定型ABO反定型Rh 表型鑒定病人/ 獻血員主側與次側交叉配血,抗體篩選抗體鑒定直接抗人球蛋白實驗酶實驗

25、特殊血型抗原鑒定質控實驗,柱凝集血型診斷系統(tǒng)試劑卡 每張卡上有六個微柱,,,微柱內裝有一定數(shù)量、大小均一的玻璃珠和分別預置了含抗A、抗B、抗D特異性抗體,,受檢者紅細胞進入測試柱與相應抗體反應經低速和高速雙相離心，發(fā)生凝集的紅細胞被阻滯在玻璃珠的上層（陽性），而未凝集的游離紅細胞則會通過玻璃珠介質之間的間隙沉積于柱的底部（陰性）,達到血型鑒定的目的。,,用于人紅細胞ABO/Rh 血型正定型的原理,微柱凝膠試驗示意圖,標本采集和要求

26、血液的采集,用真空采血針取肘靜脈血3ml放入含有干燥抗凝劑的抗凝管中，并做好標識。 采集后的標本可室溫保存4小時，并在6小時內測定。,見習內容,五號柱：抗-B試劑,四號柱：抗-A試劑,ABO-Rh血型診斷試劑卡,故每一試劑卡可用于2份人血標本ABO/Rh鑒定,一號柱：抗-A試劑,二號柱：抗-B試劑,三號柱：抗-D試劑(抗-RH1),六號柱：抗-D試劑(抗-RH1),,全自動血型分析系統(tǒng)基本技術流程圖,技術流程,樣本加樣,患

27、者樣本放置在儀器正面的一扇門后面，位于AutoVue的左邊，由移液探針執(zhí)行樣本吸取并將樣本輸送到檢測區(qū)這一步驟，請參見黃色線描出的部分。,樣品裝載意示,AutoVue可以自動進行結果的讀取與分析,自動讀取器在系統(tǒng)內部離心機所在位置附近,讀取試劑卡兩面的信息高清晰度圖像處理系統(tǒng)標準化和客觀的反應分級如果需要則可進行結果的人工判讀讀取QC來定標試劑卡,結果讀取,若紅細胞聚集在玻璃珠上部，則表明紅細胞發(fā)生凝集，是陽性反應；紅細胞沉積

28、在玻璃珠底部，則表明紅細胞未發(fā)生凝集，是陰性反應?；趫D像分析的判讀系統(tǒng)會自動判讀ABO血型（A/B/AB/O型 ，如第一、二柱均為陰性反應，則判為O型；第一柱呈陽性反應、第二柱呈陰性反應，則判為A型；第一柱呈陰性反應、第二柱呈陽性反應，則判為B型。）和RH血型（陽性/陰性，第三柱呈陽性反應判為Rh陽性；第三柱呈陰性反應判為Rh陰性。）。,結果報告,O型Rh陽性,A型Rh陽性,,,結果判讀標準：4+ ： 凝集的細胞全部處于微管的頂部

29、 3+ ： 80%的紅細胞沉在微管的上端1/3之內 2+ ： 80%的紅細胞沉在微管的上端2/3之內 1+ ： 80%的紅細胞沉在微管的下端2/3之內 0： 陰性。100%的紅細胞沉在微管的底部,結果為1+到3

30、+，可能存在弱抗原，需進一步驗證。,注意事項,試劑卡如冷藏（2至8℃）保存，使用前應在室溫復溫30min至60min；有些試劑卡成份可被視為具有危險性或潛在的傳染性，應按照適用的指導原則和規(guī)定處理；不適宜的存儲條件可能會影響產品質量。如每個試劑盒卡的架子外面都貼有一個圓形的溫控指示點。如果指示點圓圈內為藍色，說明試劑卡曾被暴露在可能影響產品質量的溫度環(huán)境中，使用這些試劑卡時可能出現(xiàn)假陰性的檢測結果。請勿使用這樣的試劑卡；請勿使用表

31、面破損的試劑卡（如封口膜破裂，柱中有裂隙或氣泡）或微柱內試劑液體明顯干涸（即液面低于玻璃珠介質）或褪色的試劑卡（由細菌污染引起，可導致假陽性檢測結果）。,儀器維護和質控 每日維護執(zhí)行探針清除污染：點擊維護菜單，點擊探針清除污染按鈕，點執(zhí)行，根據(jù)儀器提示進行操作，首先在10ml小瓶中裝好0.1mol/L的NaOH 溶液，放入試劑架相應位置，點繼續(xù)，系統(tǒng)自動進行清洗。清除廢棄物容器中的廢棄試劑卡：點擊廢棄物艙門按鈕，打開廢棄

32、物艙門，清出廢棄物容器并提起固定架，取出廢棄物袋，插入一新的廢棄物袋。清空液體廢棄物：確認設備電源處于關閉狀態(tài)，卸下液體廢棄物容器的連接管，根據(jù)所在實驗室處理液體廢棄物的指導原則處置液體廢棄物并清潔容器，重新連接好廢液連接管。,每周維護試液回路清潔：點擊維護菜單，點擊試 液回路清潔按鈕，點執(zhí)行，根據(jù)儀器提示進行操作。設備清潔：點擊 維護 菜單，點擊設備清潔，點執(zhí)行，根據(jù)儀器提示進行操作。,質控當在系統(tǒng)上運行常規(guī)檢測時使用質控品作

33、為樣本進行內部質控。使用質控試劑卡進行質控：點擊質控自動讀取器按鈕，點擊執(zhí)行，顯示質控自動讀取器對話框，按照屏幕提示啟動自動讀取器質控步驟。,見習報告通過見習，敘述全自動血型分析系統(tǒng)的檢測原理。簡述全自動血型分析系統(tǒng)的儀器構成、操作流程、影響因素及解決的措施。全自動血型分析系統(tǒng)可以檢測哪些項目？有何臨床意義？