印度洋深海多環(huán)芳烴降解菌的多樣性分析及降解菌新種的分類鑒定與降解機理初步研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(polyaromatic hydrocarbons，PAHs)是指分子中含有兩個或兩個以上苯環(huán)的烴類，在環(huán)境中持久存在，具有廣泛的毒性、致突變性、致癌性。探索PAHs在環(huán)境中的歸宿問題，已發(fā)展成為當今環(huán)境科學研究的前沿課題之一。生物，尤其細菌是去除環(huán)境中PAHs的主力軍。而深海環(huán)境中與PAHs等有機污染物降解有關的細菌還很大程度上不為人知。尋找高效的PAHs降解細菌，研究其降解基因，探索其代謝途徑，能更加有效的將降解菌應用于生

2、物修復。 本論文主要對印度洋西南洋中脊深海環(huán)境中PAHs降解菌的多樣性和重要的PAHs降解菌進行了研究。采集了西南印度洋中脊熱液區(qū)附近1個水柱(DY10517A IR-CTD5)的9個深海水層海水樣品用混合PAHs(菲、芘、熒蒽、蒽)和單一PAH為碳源進行富集篩選，得到了9個混合PAHs降解菌群和9個菲降解菌群。采用DGGE和單菌分離培養(yǎng)相結(jié)合的方法對菌群多樣性及菌群富集過程的動態(tài)變化進行了分析。同時對2株重要的PAHs降解新菌

3、進行了分類鑒定、基因組學和代謝組學方面較為系統(tǒng)的研究，探討其降解特性，分析了相關功能基因，推測出了可能的代謝途徑。獲得的主要結(jié)果如下： 1.用混合PAHs和單一菲作為碳源，富集印度洋深海海水樣品，獲得了高效的PAHs降解菌群和菲降解菌群。采用平板分離法，在9個混合PAHs降解菌群中分離到29個不同的屬的168株可培養(yǎng)細菌。可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，它們分別屬于6個大類，其中主要是變形菌綱α亞群(62％)和γ亞群(23％)細菌

4、，其它4類分別為變形菌綱β亞群(3％)、高G+C革蘭氏陽性菌類群(3％)、CFB類群(6％)和低G+C革蘭氏陽性菌類群(3％)。其中α亞群包含29個屬中的18個屬，種屬多樣性十分的豐富。單菌降解實驗表明，分離獲得的大多數(shù)菌株都能利用PAHs進行生長。其中Alterierythrobacter，Bacillus、Citricella、Idiomarina、Lutibacterium、Maricaulis、Thalassospira、Mar

5、telella、Pseudidiomarina，Roseovarius、Salipiger等菌屬未有過PAHs降解的相關報道。 2.采用PCR-DGGE法對PAHs降解菌群和菲降解菌群跟蹤分析了PAHs降解菌群和菲降解菌群中優(yōu)勢菌的形成過程和菌群的結(jié)構動態(tài)變化。分析結(jié)果表明，雖然不同水層和不同時期的菌群有所不同。但與新鞘氨醇桿菌、食烷菌、節(jié)桿菌、巴爾通氏體菌、Azospirillum和Rhodovulum等菌屬近緣的菌株是菌群中

6、最常見的優(yōu)勢菌或較優(yōu)勢的菌。其中巴爾通氏體菌、Azospirillum和Rhodovulum等菌屬還沒有降解PAHs的相關報道，可能是潛在的海洋PAHs降解菌。動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，第8d是混合PAHs降解菌群富集過程中的關鍵時期，此時菌群結(jié)構變化較明顯。此時菌群中對PAHs的代謝可能已經(jīng)由菲轉(zhuǎn)到對其他PAHs的降解。相比之下，菲的降解菌群在4d時趨近穩(wěn)定，此后菌群結(jié)構沒有非常明顯的變化。 3.從DY10517A IR-CTD5站位的深

7、海水樣中分離了一株高效的PAHs降解菌H25，其16S rRNA基因與新鞘氨醇桿菌屬的Novosphingobium pentaromativorans US6-1T有最高同源性為96.0％。通過生理生化特性、脂肪酸成分的分析，G+Cmol％的測定和DNA-DNA雜交結(jié)果表明菌株H25為新鞘氨醇桿菌屬的一個新種，命名為(Novosphingobium indicum)。芳環(huán)羥基化雙加氧酶(ring-hydroxylating dioxy

8、genase，RHDs)是PAHs降解過程中控制苯環(huán)的起始加氧，是微生物降解反應的限速步驟。我們通過引物設計，從該菌株中擴增出了兩條含有PAHs降解起始雙加氧酶大小亞基及其上下游序列的基因片段。比對發(fā)現(xiàn)，H25菌株含有至少兩套與芳烴降解有關的雙加氧酶系統(tǒng)，能較好的利用多種PAHs。這說明在研究不多的未受污染的深海區(qū)域蘊藏著許多具有清除有機污染潛力的菌種，是值得進一步探索和研究的新領域。 4.對本實驗室從西南印度洋中脊沉積物樣品(

9、DY10517A IR-TVG4站點)分離到的Pseudoruegeria屬新菌株PTG4-1進行了鑒定。通過16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，生理生化特性的比較，脂肪酸成分的分析及G+Cmol％的測定，確定該菌株為Pseudoruegeria屬的一個新種(Pseudoruegeria indicum)。對該菌株的PAHs降解范圍和降解率進行了測定發(fā)現(xiàn)，該菌株是一株廣譜、高效的PAHs降解菌，在環(huán)境生物修復中具有較大的應用前景。為