血吸蟲抗獨特型抗體np306215;v,hcdr3hil2融合基因的構建及表達

1、南京醫(yī)科大學碩士學位論文血吸蟲抗獨特型抗體NP30 6×VCDR3/hIL-2融合基因的構建及表達姓名：徐瑋申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學指導教師：馮振卿20030420南京醫(yī)科火學碩二L 學位論文( 表的h I L - 2 基因序列分別設計一對引物，為便于克隆和表達，在引物兩端引進合適的酶切位點和保護性堿基。分別以質粒p F U W 8 0 —6 x V H C D R 3 、p S S K - I 為模板，進行聚合酶鏈反應

2、( P C R ) 。擴增產物純化后，將其克隆八p U C m - T v e c t o r ，挑選陽性克隆測序。2 ．將通過P C R 方法體外擴增并經測序驗證的N P 3 0 6 ×V H C D R 3和h l L ．2 基因，先后重組入原核表達載體p E T - 2 8 “+ ) 相應的位點上，構建成p E T - 2 8 a ( + ) 一6 x V H C D R 3 ／h l L 一2 表達載體。3 ．通過重組

3、克隆的篩選，將構建正確的融合基因表達載體轉化E ．c o l iB L 2 1 ，I P T G 誘導表達，S D S ．P A G E 確定分子量和產量，并將表達產物初步純化。4 ．3 6 只B A L B ／c 小鼠( 6 ～8 周齡，體重1 8 ～2 0 9 ) 隨機分成3組，每組1 2 只。第一組為對照組，第二組為融合蛋白組，第三組為N P 3 0 組。在0 ，2 ，4 周分三次免疫，實驗組每鼠腹腔注射融合蛋白l O O g l

4、 ( 2 0 0 1 a g ／m 1 ) ；N P 3 0 組每鼠腹腔注射N P 3 01 0 0 9 l ( 2 0 0 9 9 ／m 1 ) ；對照組于每只小鼠腹腔注射生理鹽水1 0 0 1 x l 。最后一次免疫后二周，尾蚴腹部皮膚攻擊感染，2 8 天后處死小鼠。經門脈灌注，計數(shù)每只小鼠的蟲荷，計算減蟲率。研究結果1 ．P C R 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳可見2 0 0b p 及4 0 0b p 特異性條帶，與預期大小一致。序列測

5、定結果表明，N P 3 06 x V H C D R 3 基因全長1 8 0 b p ，編碼6 0 個氨基酸殘基；h l L 一2 基因全長3 9 9 b p ，編碼1 3 3個氨基酸殘基，有一個鏈內二硫鍵( C y s 5 8 一C y s l 0 5 ) 。2 ．表達質粒經抗生素抗性、藍白斑篩選、P C R 及行E c o R I 、H i n dI I I ／H i n d I I I 、X h o I ／艮以I 、X h o I