豬瘟病毒疫苗株反向遺傳學(xué)改造.pdf

1、豬瘟（Classical swine fever,CSF），別名豬霍亂，俗稱(chēng)“爛腸瘟”，是豬的一種高感染性的疾病，致死率高達(dá)90％以上，是威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。豬瘟的爆發(fā)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類(lèi)傳染病，受到了各個(gè)國(guó)家的高度重視，成為了各個(gè)國(guó)家研究的熱點(diǎn)。豬瘟的病原豬瘟病毒是一種包膜病毒，大小約40-60nm，它的基因組大小約12.3kb，是單股正鏈RNA，包含了一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（ORF），一個(gè)5'非編碼區(qū)

2、（5'UTR）和一個(gè)3'非編碼區(qū)（3'UTR）。ORF能夠編碼大約3900個(gè)氨基酸的多聚蛋白，然后在信號(hào)肽酶等作用下產(chǎn)生12個(gè)成熟蛋白，順序依次為Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4 A-NS4B-NS5A-NS5B。其中，C、Erns、E1、E2為4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NA4B、NS5A、NS5B為8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。
　　本研究分為兩個(gè)部分：第一部分根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的豬

3、瘟病毒感染性的cDNA，通過(guò)插入CMV啟動(dòng)子和錘頭狀核酶構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pMC18-CMV-HM-CSFV，并用于豬瘟病毒的拯救。為了驗(yàn)證錘頭狀核酶的功能，我們構(gòu)建了pGL2.0-CMV、pGL2.0-CMV-HM、pGL2.0-C MV-HM'和 pGL2.0-CMV-HM-5'UTR四個(gè)質(zhì)粒。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（Real-time Quantitative PCR Detecting Sys

4、te m,QPCR）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后，錘頭狀核酶能夠發(fā)揮約62%的剪切作用。經(jīng)過(guò)QPCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，改造后的質(zhì)粒 pMC18-CMV-HM-CSFV通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞成功拯救出了病毒。本研究為豬瘟疫苗的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。第二部分探究了豬瘟病毒C蛋白與5'UTR的關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn)，豬瘟病毒的C蛋白對(duì)3'UTR具有調(diào)節(jié)作用。為了確定C蛋白與5'UTR之間是否存在相互作用關(guān)系，我們分別構(gòu)建了雙熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pMIR-5

5、'UTR-RLUC和pMIR-RLUC。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)證明，pMIR-5'UTR-RLUC轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后，5'UTR能夠發(fā)揮相應(yīng)的作用。將豬瘟病毒C蛋白的真核表達(dá)載體pCMV-C與5’UTR 的真核表達(dá)載體pMIR-5'UTR-RLUC共轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞，然后通過(guò)western blotting檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（Real-time Quantitative PCR Detecting S