RGD共價結合氧化石墨烯生物活性界面的構建及其生物性能研究.pdf

1、氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）是石墨烯（Graphene, GN）的氧化衍生物，因具有豐富的含氧功能團而易于表面功能化修飾，功能化的氧化石墨烯在生物傳感器的制造和骨組織工程的應用正在擴大。然而，當前報道對氧化石墨烯的RGD肽功能化修飾需要引入第三種鏈接分子，不但增加了實驗體系的復雜性，而且有可能改變氧化石墨烯自身的物理化學性能。因此，提供一種更為直接、簡單的方法實現(xiàn)氧化石墨烯表面生物功能化，并研究其生物性能顯得很有必

2、要。
　　RGD肽也被稱為細胞粘附肽，能夠促進細胞粘附、增殖和分化。RGD肽與GO的結合能否增強細胞的活性、能否作為細胞生物傳感器界面應用于體外細胞學分析、能否應用于骨組織工程，值得我們?nèi)パ芯刻剿鳌?br>　　目的：1、通過EDC/NHS耦合反應將RGD肽共價修飾GO，合成一種新型的RGD-GO生物膜，并對其進行表征；通過RGD-GO生物膜修飾ITO電極作為傳感電極，研究其在電化學生物傳感器的應用；2、研究RGD-GO生物膜促進C

3、3H10T1/2干細胞體外成骨分化的能力；3、考察RGD-GO生物膜體內(nèi)生物相容性；4、研究RGD-GO生物膜復合C3H10T1/2干細胞裸鼠皮下異位成骨的能力，將其在骨組織工程中的應用進行初步的探索。
　　方法：1、將GO水溶液通過自然干燥形成GO薄膜，通過EDC/NHS耦合反應，將具有胺功能團的RGD肽固定在GO膜表面，形成RGD-GO生物膜。原子力顯微鏡對修飾前后 GO表面進行形貌學表征，傅里葉變換紅外光譜測量修飾前后 GO

4、化學成分變化，接觸角測量儀對合成材料的親疏水性進行測量。同時，RGD-GO生物膜表面電化學性質通過電化學阻抗譜（EIS）進行表征。2、分別在RGD-GO生物膜/GO膜上培養(yǎng)人牙周膜成纖維細胞(HPDLFS)，CCK8檢測比較細胞活力，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架情況，通過image J軟件（NIH）分析細胞在兩種材料表面的粘附差異；將RGD-GO生物膜修飾在ITO電極表面，顯微鏡下觀察培養(yǎng)在 RGD-GO生物膜修飾的 ITO電極表面H

5、PDLFS的生長情況，通過電化學阻抗譜技術（EIS）檢測和對比分析HPDLFS細胞在RGD-GO生物膜/GO膜修飾電極表面的增殖粘附行為，通過EIS檢測脂多糖對HPDLFs細胞活力的影響，并以CCK-8實驗做為對照。3、以C3H10T1/2為干細胞模型，在RGD-GO生物膜表面培養(yǎng)不同時間后，通過顯微鏡觀察材料表面細胞的生長形態(tài)、激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架情況；通過檢測堿性磷酸酶活性、堿性磷酸酶染色實驗、茜素紅染色實驗、熒光定量PC

6、R檢測成骨相關基因OPN、OCN、Runx2的表達，考察在RGD-GO生物膜上培養(yǎng)的C3H10T1/2干細胞在未加成骨誘導因子的情況下成骨分化的能力；4、以臨床常用植骨材料Bio-Oss為對照、將RGD-GO生物膜同期植入SD大鼠背部皮下，通過大體觀察和形態(tài)組織分析，對比研究RGD-GO生物膜的體內(nèi)生物相容性；5、RGD-GO生物膜復合 C3H10T1/2干細胞植入裸鼠背部皮下，以臨床常用植骨材料Bio-Oss為對照，通過大體觀察、HE

7、染色、Masson染色、免疫組化染色，考察其異位成骨能力。
　　結果：1、與GO膜相比，RGD-GO生物膜線粗糙度和面粗糙度增加，親水性提高，F(xiàn)T-IR檢測發(fā)現(xiàn)，RGD-GO生物膜1732 cm-1的羧基（C-OH）吸收峰減弱，增加了1533 cm-1和1290 cm-1兩處吸收峰，而該兩個波數(shù)吸收峰分別對應RGD肽的酰胺I和酰胺II的特征峰；電化學性質檢測發(fā)現(xiàn)：RGD肽共價修飾在GO表面后，Rct值從2.1E4Ω增加至4.7E4

8、Ω, CPE-T值進一步增加至5.3E-6C。2、HPDLFS在兩種膜表面的細胞活力都隨著培養(yǎng)時間延長逐漸增加，但在RGD-GO生物膜上呈現(xiàn)更高的增殖能力（P＜0.05）。激光共聚焦顯微鏡下顯示：RGD-GO生物膜表面細胞密度值顯著高于 GO膜表面細胞密度值，RGD-GO生物膜表面細胞鋪展面積顯著高于GO膜表面的細胞平均面積（P＜0.05）。顯微鏡下顯示HPDLFs能夠培養(yǎng)在RGD-GO生物膜修飾的ITO電極表面；其粘附增殖的電化學阻抗

9、分析測量顯示：隨著HPDLFS在RGD-GO生物膜修飾的ITO電極表面的粘附和增殖，Ccell在2h~24h迅速降低，細胞鋪展形成細胞單層時，Ccell穩(wěn)定在8.2~8.5nF（72h），略高于HPDLFS在GO修飾的ITO電極表面的7.6~8.1nF；HPDLFS在RGD-GO生物膜修飾的ITO電極表面增殖中的Rcell值持續(xù)增大，形成細胞單層(72h)時Rcell值達到最大，約為1382Ω，在HPDLFS增殖過程中（24h及48h）

10、，細胞在RGD-GO生物膜修飾ITO電極表面的Rcell值高于細胞在GO修飾ITO電極表面的Rcell值；HPDLFS細胞在RGD-GO生物膜修飾ITO電極表面增殖過程中 R′S持續(xù)增大，在接種72h后達到最大值（～338Ω），且增殖過程中R′S值均高于HPDLFS細胞在GO修飾ITO電極表面增殖過程中的R′S值。這些結果與細胞計數(shù)結果相吻合。以RGD-GO生物膜為電化學阻抗譜檢測界面的細胞生物傳感器來研究 LP S對HPDLFS細胞增

11、殖的影響，電化學阻抗譜檢測結果與CCK-8測定的結果相似。3、C3H10T1/2細胞接種在 RGD-GO生物膜表面后，顯微鏡和激光共聚焦均顯示：RGD-GO生物膜能夠支持細胞粘附伸展并促進細胞粘附增殖。與 GO相比，RGD-GO生物膜表面細胞分別在培養(yǎng)3天、5天、7天、9天時堿性磷酸酶活性持續(xù)增高（P＜0.05），培養(yǎng)9天后堿性磷酸酶染色呈現(xiàn)陽性，培養(yǎng)14天后茜素紅染色陽性；在培養(yǎng)9天后成骨相關基因OPN、OCN、Runx2的表達水平顯

12、著高于GO組和對照組（P＜0.05）。4、RGD-GO生物膜植入 SD大鼠皮下2周、4周、8周、12周后，與Bio-Oss骨支架材料一樣均未見炎癥細胞和異物巨噬細胞，而且植入材料與組織界限逐漸清晰，由最初的薄層纖維樣物到形成纖維膜樣物、周圍纖維組織逐漸增厚，植入皮下材料范圍逐漸減小。5、裸鼠皮下植入8周后HE染色、Masson染色結果顯示復合了干細胞的Bio-Oss/ RGD-GO均為陽性，免疫組化分析可見成骨的基質或骨樣組織。

13、　　結論：1、本實驗成功的合成了RGD-GO生物膜，所獲得的RGD-GO生物膜具有好的穩(wěn)定性和特殊的電化學特征，能夠作為新型的細胞傳感器界面實現(xiàn)細胞體外電化學檢測分析。2、RGD-GO生物膜具有良好的體外生物相容性，具有增強細胞粘附增殖、誘導干細胞成骨分化的能力，在未加成骨誘導液的前提下可以實現(xiàn)C3H10T1/2干細胞的成骨分化。3、RGD-GO生物膜具有良好的體內(nèi)生物相容性；體內(nèi)異位成骨實驗表明復合了C3H10T1/2干細胞的RGD-