紅外和近紅外分光法及其在蛋白分子研究中的應用.pdf

1、紅外和近紅外分光法的優(yōu)點在于，能夠直觀地獲取分子振動的光譜信息，并且對任何樣品在任何狀態(tài)下都能檢測，它們作為無損、快速的分析方法已經被廣泛地應用于生物、醫(yī)學等領域。為了更好地利用紅外和近紅外光譜研究蛋白分子的結構和特性，人們不斷地提出新的實驗手段和光譜分析方法，但是仍然存在一些難題沒有很好地解決，特別是溶液中蛋白分子的二級結構、水合作用及其動力學過程還有待進一步闡明。此外，雖然分子振動理論早已完善，但是隨著計算機技術的發(fā)展，利用分子振動

2、理論與計算機輔助相結合解析分子振動狀態(tài)的研究工作也有必要進一步完善。 本論文利用紅外和近紅外光與分子相互作用的理論，通過對加熱導致的溶液中蛋白分子的變性過程的分析，對溶液中蛋白分子的二級結構、水合作用及其熱動力學特性進行了詳細的研究。在研究中，采用了計算機輔助分子振動分析、光譜解析和光譜實驗相結合的手段。首先，利用分子振動理論與計算機輔助相結合，系統(tǒng)地研究了分子的振動狀態(tài)并總結了其規(guī)律；其次，在實驗上通過對溶液中蛋白分子的熱動力

3、學紅外和近紅外光譜的檢測和解析，研究了蛋白分子的二級結構、水合作用及其熱動力學過程；再次，在參與分光光度計項目研究的基礎上，對紅外和近紅外光譜實驗方法和實驗裝置進行了研究。 在本論文中，所完成的研究工作和取得的研究結果概要如下：(1)分子振動理論方面：①從經典和量子力學理論的角度對分子振動理論進行了闡述。②利用分子振動理論與計算機輔助相結合研究了不同結構分子的振動狀態(tài)，特別模擬了分子的內坐標力常數(shù)對分子振動基頻的影響，為分子光譜

4、實驗和光譜解析提供了指導。 (2)在紅外分光法對重水溶液中BSA的研究中，主要利用酰胺Ⅰ譜帶解析了蛋白分子在重水溶液中的二級結構及其熱動力學過程，不同的分析方法所獲得的結果為：①二階導數(shù)光譜和曲線擬合用于分離來源于不同二級結構的譜帶。在26℃時，BSA的二級結構含有62.54﹪的α-螺旋、29.11﹪的β-鏈、7.76﹪的β-轉角以及不含β-片層；在90℃時，含有18.20﹪的α-螺旋、31.53﹪的β-鏈、25.11﹪的β-轉

5、角、19.70﹪的β-片層和5.46﹪的無規(guī)卷曲。結果表明，在升溫過程中，二級結構的變化表現(xiàn)為：α-螺旋的減少不僅僅伴隨著β-片層的形成，而且還伴隨著β-轉角的增加和無規(guī)卷曲的形成。②相關性分析和漸進因子分析(Evolvingfactoranalyais，EFA)用于解析重水溶液中蛋白分子二級結構變化的熱動力學特性。它們的結果均表明，在升溫過程中，BSA的顯著結構變化發(fā)生在溫度區(qū)間70-82℃。此外，三因子漸進因子分析的結果顯示，加熱導

6、致的重水溶液中BSA的結構變化發(fā)生在兩個溫度區(qū)域——56-70℃和70-82℃，其中56-70℃的結構變化比較微小，僅表現(xiàn)為β-片層的形成，而70-82℃附近的結構變化表現(xiàn)為β-片層和β-轉角的增加以及無規(guī)卷曲的形成。③二維相關光譜用于解析不同二級結構之間在加熱過程中的相關性變化。同步相關光譜的結果顯示，在加熱過程中α-螺旋與β-片層和β-轉角之間有很強的協(xié)同變化，這表明α-螺旋的減少導致了β-片層和β-轉角的增加。異步相關光譜的結果顯

7、示，在加熱過程中，最早發(fā)生變化的是α-螺旋結構，β-片層結構的變化要早于β-轉角、β-鏈、無規(guī)卷曲的變化。 (3)在近紅外分光法對水溶液中BSA的研究中，7500-5500cm-1和4900-4200cm-1兩個光譜區(qū)域分別用于研究BSA在溶液中的水合作用和二級結構，所獲得的結果為：①水溶液中BSA的溫度相關差光譜在光譜區(qū)間7200-6600cm-1的光譜強度變化顯示了由于加熱引起的BSA水合作用的變化。BSA水溶液中的水分子可

8、以分為自由水和束縛水兩類，自由水具有與純水相近的結構，而束縛水在加熱過程中會從蛋白分子的表面移去而成為自由水。水溶液中BSA的水合作用的熱動力學過程變化表現(xiàn)為溶液中束縛水向自由水的轉化。②水溶液中BSA的溫度相關差光譜在光譜區(qū)間4650-4500cm-1的光譜強度變化顯示了由于加熱引起的BSA二級結構的變化。隨著溫度的升高，4600cm-1附近吸收峰的強度變小并且略向高波數(shù)移動，表明BSA二級結構中α-螺旋的減少和氫鍵作用對NH鍵的影響

9、減小了；在高溫時，一個新的肩峰在4530cm-1附近出現(xiàn)，表明BSA二二級結構中形成了β-片層，這證實了4600cm-1附近的譜帶可用于蛋白分子二級結構檢測的可能性。③相關性分析和漸進因子分析用于解析水溶液中BSA的結構和水合作用的熱動力學特性。在加熱過程中，BSA水合作用的劇烈變化發(fā)生在73℃附近，而BSA結構的劇烈變化發(fā)生在71℃附近，即水溶液中BSA的結構變化發(fā)生在水合作用之前，換句話說，蛋白分子的顯著水合作用的變化是由于二級結構

10、的改變引起的。 (4)在紅外和近紅外光譜的實驗方法和實驗裝置的研究方面：①對目前的紅外和近紅外分光光度計中所使用的光源、檢測器、分光系統(tǒng)進行了歸納和總結。②針對光柵色散式的分光光度計中的光譜級次重疊問題，提出了一種新的光譜純凈方法，根據(jù)該方法設計的濾光片能夠滿足全譜并行測量的要求，適用于超快速光譜分析的應用。③結合計算機和網絡技術，提出了具有遠程訪問功能分光光度計的設想，這一功能已在自主開發(fā)的分光光度計中得以應用，遠程功能在一定

11、程度上擴大了分光光度計的使用空間范圍。④提出了一種用于溶液樣品和微量液體的近紅外光譜測量的毛細管法，通過與采用常規(guī)的近紅外樣品池所獲得的光譜進行比較，證實了毛細管法的可靠性。毛細管法具有節(jié)省樣品、便于取樣、不需清洗樣品池等優(yōu)點，這使得它能夠適用于生物醫(yī)學上的應用研究。 本論文的研究工作，在計算機輔助研究分子振動狀態(tài)方面進行了有益的探索，對溶液中蛋白分子的二級結構、水合作用及其熱動力學特性進行了總結并獲得了對它們的新的認識，提出了

12、紅外和近紅外光譜的實驗方法和實驗裝置的新的設計。研究結果不僅對分子振動的理論研究提供了新的思路，而且對于紅外和近紅外分光法對蛋白分子的應用研究具有一定的參考價值。論文中所提出的觀點以及創(chuàng)新性歸納如下：①首次將漸進因子分析引入到對蛋白分子的紅外和近紅外光譜解析當中，并論證了它是解析動力學過程的有力工具。 ②在利用近紅外分光法研究蛋白分子的水合作用中，論證了加熱導致的蛋白分子水合作用的變化機理實質上是溶液中自由水和束縛水之間的轉化。