Exendin-4對體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(HRPE)的氧化應(yīng)激水平以及PEDF、VEGF分泌的影響.pdf

1、目的：糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由各種代謝紊亂的引起的綜合征，認為是遺產(chǎn)原因和環(huán)境原因的彼此作用而引起的。迄今為止，我們認為，糖尿病的慢性并發(fā)癥可由多種因素引起，但是常被人們所接收的4條途徑為：即氨基己糖途徑、多元醇通路激活、晚期的糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycationend products,AGEs）增加、蛋白激酶C的（protein kinase C,PKC）激活，這些途徑的本質(zhì)都是高糖引起

2、的氧化應(yīng)激的產(chǎn)物過分表達的成果，故糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素是氧化應(yīng)激。處于高糖應(yīng)激狀態(tài)下的機體，清除氧自由基的能力下降，氧自由基堆積，氧化系統(tǒng)與抗氧化防御系統(tǒng)的失衡，損傷了組織和細胞。視網(wǎng)膜富含多不飽和脂肪酸，具有高度攝取氧和氧化葡萄糖的能力，而RPE細胞處于脈絡(luò)膜毛細血管層與光感受器細胞層之間的高氧環(huán)境，對于缺氧及氧化應(yīng)激更為敏感。DM引起的糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是目前為止致盲率極

3、高的，最嚴重的眼部并發(fā)癥。多種病理機制參與 DR的形成。DR的新生血管及其纖維蛋白的生成、血-視網(wǎng)膜屏障破壞是其基本病理變化。新生血管的產(chǎn)生是臨床治療該病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，疾病的后面階段所引起玻璃體內(nèi)積血和由于粘連而拉扯而發(fā)生的視網(wǎng)膜剝離，嚴重影響視力，疾病發(fā)展嚴重時，可導致失明。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial gro

4、wth factor,VEGF)分別作為主要的血管抑制因子與血管刺激因子，這兩者之間的平衡性調(diào)節(jié)對于新生血管的生成是相當重要的。有研究表示，升高的血糖可以打破視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細胞中的VEGF和PEDF之間的動態(tài)平衡，使VEGF異常增多，從而引起RPE細胞的病理性增生。DR的發(fā)生發(fā)展需要多個因素的參與，DR的重要的病理環(huán)節(jié)即血-視網(wǎng)膜屏障功能破壞及視網(wǎng)膜病理性血管生成，認為高糖

5、打破的VEGF和PEDF之間的動態(tài)平衡時誘導前兩個重要的病理環(huán)節(jié)的直接誘導因素。Dong等專家認為VEGF過度分泌被過度的氧化反應(yīng)所刺激，從而引起了視網(wǎng)膜的病理性血管的生成，因此，故在DM引起的DR中抗氧化劑，是具有臨床意義的。研究證明了胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide-1,GLP-1）及其相類似物能夠抵抗氧化應(yīng)激過分反應(yīng)、改善動脈粥樣硬化，改善血管內(nèi)皮的功能，具有降低心血管事件風險的潛在益處，這些研究提示

6、胰高血糖素樣肽-1保護RPE的作用可能與抗氧化抗炎作用有關(guān)。Exendin-4(E4)是一種毒蜥蜴的唾液中分離出的一種天然GLP-1類似物，與哺乳動物的GLP-1具有較高的同源性。E4具有促進胰腺胰島素的生成、增加其敏感度、改善胰島細胞的正常生理作用，且不被二肽基肽酶IV（Dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV）分解，血漿半衰期較長，故此藥物運用在臨床對糖尿病治療，是具有穩(wěn)定性和長效性的。故本實驗應(yīng)用不同濃度的E4

7、作用于在高糖環(huán)境下，體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(human retinal pigment epithelial,HRPE)細胞株ARPE-1948h，并且觀察細胞的活力、細胞的形態(tài)、氧化應(yīng)激指標及其PEDF、VEGF分泌的影響。
　　方法：ARPE-19細胞株，在人體外培養(yǎng)48h，并隨機的分成5個實驗組：（1）、正常參照組（葡萄糖濃度為：5mmol/l）；（2）、高糖組（葡萄糖濃度為:25mmol/L）；（3）、高糖＋E4（

8、12nmol/L）組；（4）、高糖＋E4（60nmol/L）組；（5）、高糖＋E4（120nmol/L）組。各組細胞在C O2水平（5％）、溫度（37℃）的細胞培養(yǎng)箱中，應(yīng)用上述不同條件的培養(yǎng)液在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，選取處于處于對數(shù)生長期的細胞來做相關(guān)實驗。觀察HRPE細胞活力和形態(tài)，比色法檢測總超氧化物歧化酶（total-superoxide dismutase,T-SOD）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、和丙二醛（

9、malondialdehyde,MDA）的變化，HRPE細胞的上清液中PEDF與VEGF的含量用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法來測定，研究在高糖環(huán)境下，Ex-4對HRPE細胞的保護機制，從而更進一步研究此藥物對治療DR的作用機制。
　　結(jié)果：
　　1.對比正常參照組，高糖組的GSH含量、總-SOD的活性顯著下滑，然而MDA的含量顯著提高(P＜0.05);E4(12,60,120nmol/L)作用后，與高糖組對比，各給

10、藥組GSH含量及總-SOD活性都有相應(yīng)的提高，而MDA含量均下滑(P＜0.05），并且有濃度依賴性。
　　2.對比正常參照組，高糖組PEDF分泌含量顯著下滑，VEGF分泌含量顯著提高(P＜0.05）;E4(12,60,120nmol/L)作用后，與高糖組對比，各給藥組的PEDF的分泌量提高，同時降低VEGF的分泌量，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05），并且有濃度依賴性。
　　結(jié)論：
　　1.在高糖環(huán)境的作用下，將增強 HR

11、PE氧化應(yīng)激的水平，同時使血管刺激因子與血管抑制因子之間的調(diào)節(jié)失衡，造成PEDF分泌量的下滑，然后VEGF分泌量的增多，我們認為，這很大程度上是與DR的發(fā)生發(fā)展進程有關(guān)。
　　2.一定濃度的E4Ex-4可降低在高糖環(huán)境下作用的HRPE細胞的氧化應(yīng)激指標，PEDF分泌增多和VEGF分泌減少。這就提示了E4可能的作用機制，即通過對氧化作用和抗氧化作用之間的調(diào)節(jié)，進而調(diào)節(jié)PEDF和VEGF的平衡，從而使HRPE細胞得以保護，抑制了DR病