KLF4對小鼠成骨細胞成骨分化及基質分泌的影響.pdf

1、目的：
　　牙周炎(periodontal disease)是威脅人類口腔健康的常見病之一，是細菌及代謝產物介導的作用于牙周支持組織的具有慢性破壞性的疾病。牙周炎主要臨床表現(xiàn)為牙槽骨的吸收破壞，病理學變化顯示為骨新生的不足—骨生成與骨吸收失衡所致。由于牙周炎患病率高，與全身的健康密切相關，目前其臨床治療方式主要為對癥處理，控制牙周炎的繼續(xù)發(fā)展，對牙周炎所造成的骨質缺損尚無有效的治療措施，因此深入探索骨形成的機制對于牙周炎的防治具有

2、極其重要的作用。
　　骨平衡是一個動態(tài)變化過程，成骨細胞所引起的骨生成與破骨細胞所導致的骨吸收之間的平衡統(tǒng)一是維持骨代謝穩(wěn)態(tài)的關鍵。大量研究表明若骨形成少于骨吸收時，將導致如骨質疏松、牙周病、骨關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎等骨疾病;反之則導致骨硬化疾病。其中，成骨細胞為骨代謝平衡的主導因素之一，其活性可以被多種因素調節(jié)。因此骨生成的分子機制的研究對提高骨疾病所導致缺損的修復治療效果具有臨床意義。
　　越來越多的研究都集中在成骨細胞的

3、發(fā)生、增殖、分化中，這表明了在骨相關疾病中成骨細胞對骨再生的重要性?；谝陨戏治?，本研究擬通過成骨細胞分離培養(yǎng)及鑒定培養(yǎng)出實驗細胞，通過過表達核轉錄因子KLF4觀察其對成骨細胞增殖及分化相關基因的影響，從而探討KLF4對成骨細胞早期成骨分化的影響;最后本研究對成骨細胞分化過程中KLF4對骨平衡所涉及的基質分泌的影響，明確KLF4在成骨細胞成骨分化中發(fā)揮的作用，為牙周疾病臨床診治進一步提出理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.利用分

4、段酶消化法從新生小鼠顱骨片中獲得成骨原代細胞，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，經成骨誘導液分別培養(yǎng)9d和21d后采取ALP染色和茜素紅染色對其進行鑒定。
　　2.采用免疫熒光技術檢測成骨細胞中KLF4的表達;成功構建攜帶KLF4的重組腺病毒載體(Ad-KLF4)，成骨細胞經不同感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的Ad-KLF4轉染后熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光表達情況并檢測轉染效率。將成骨細胞隨機分為對照

5、組（未轉染組）、KLF4組（Ad-KLF4轉染）和GFP組（Ad-GFP轉染），經最佳MOI感染后MTT測定細胞增殖，Real-time PCR檢測成骨相關基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、核心蛋白結合因子2(runt-related transcription factor2，RUNX2)的表達。
　　3.采用western-blot檢測成

6、骨細胞成骨分化過程KLF4，MMP2及COL1的表達;siRNA KLF4或者Ad-KLF4處理成骨細胞后，在成骨細胞及成骨細胞早期分化過程(0d、2d、4d)通過wester-blot及Real-timePCR觀察其對MMP2及COL1蛋白及基因表達的影響;
　　結果：
　　1.本實驗利用酶消化法從新生小鼠顱骨片中獲得細胞形態(tài)呈多邊形、立方形的成骨原代細胞。ALP染色可見細胞漿內大量沙礫狀藍染陽性顆粒，茜素紅染色可見呈細胞

7、外成片紅色礦化團塊。通過細胞形態(tài)學的觀察以及染色鑒定表明通過分段酶消化法可以分離培養(yǎng)出成骨原代細胞，為本實驗的進一步順利進行打下基礎。
　　2.經PCR擴增、基因測序成功構建出攜帶KLF4基因的重組腺病毒載體(Ad-KLF4)。成骨細胞經最適合MOI(100PFU/ml)處理后，KLF4組可觀察到KLF4蛋白及mRNA水平顯著上升;成骨細胞增殖速率明顯上升;成骨分化相關基因ALP、RUNX2、BSP的水平顯著下降。
　　3.

8、隨著成骨細胞成骨分化時間的延長，KLF4的表達不斷上升，伴隨著MMP2表達下降及COL1表達的升高。經40NM的KLF4siRNA感染后，KLF4基因及蛋白表達明顯下降，同時MMP2的表達上升，COL1的表達下降;經MOI=100PFU/ml的Ad-KLF4感染后，KLF4表達水平顯著上升，相反MMP2表達下調，COL1的基因及蛋白水平依然呈下降趨勢。
　　結論：
　　1.本實驗利用分段酶消化法成功獲得成骨原代細胞，且第二代