蛋白結(jié)合硫酸吲哚酚損傷紅細胞的研究.pdf

1、背景:
　　腎性貧血是指由于慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)而引起的貧血。其發(fā)生機制十分復(fù)雜，主要包括促紅細胞生成素，即(Erythropoietin，EPO)的相對或絕對減少，尿毒癥毒素(Uremic toxins，UTox)導致骨髓生成紅細胞障礙和紅細胞破壞過多，出血，由于消化道癥狀導致營養(yǎng)物質(zhì)攝入不足、消化不良、吸收減少，甲狀旁腺功能亢進導致骨髓病變等。腎性貧血是腎衰病人嚴重的并發(fā)癥，進而引

2、起各系統(tǒng)缺血、缺氧[1-2]。長期貧血會增加心臟負荷、引發(fā)心絞痛，慢性嚴重貧血時可引起心肌收縮力降低、射血分數(shù)降低，繼而出現(xiàn)充血心力衰竭[3]。心力衰竭可以促使腎功能更進一步惡化。貧血、腎衰、心衰這樣三種病理狀態(tài)，造成機體惡性循環(huán)，極度影響著病人生活的質(zhì)量和疾病的長期預(yù)后[4]。因此，提高尿毒癥血透病人的生活質(zhì)量、降低并發(fā)癥、提高生存率，有效糾正貧血顯得尤為重要。
　　早在10年前Lang等提出紅細胞衰亡這一定義:許多因素可破壞紅

3、細胞，誘發(fā)細胞自殺死亡或者衰亡，這種與有核細胞的凋亡類似的現(xiàn)象，由于紅細胞沒有細胞核、細胞器、線粒體（這些可以誘導細胞進入程序性凋亡），所以紅細胞不具有細胞凋亡的部分典型表現(xiàn)（譬如:核的濃縮、膜電位的消失），但是具備其他的凋亡特征（譬如:細胞皺縮、體積變小、膜囊泡化），體現(xiàn)在紅細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸，即（phosphatidylserine，PS）外露水平[5]。紅細胞膜表面外露程度的PS與機體的血紅蛋白間呈負相關(guān)關(guān)系[6-8]。以往

4、的研究表明，一些不同分子量的毒性物質(zhì)存在CKD病人血漿中，抑制骨髓生成紅細胞、破壞紅細胞而致使貧血[9]。如果將CKD病人的紅細胞輸給健康人，紅細胞生存時間會變?yōu)檎?，健康人紅細胞與尿毒癥病人血漿一起孵育時，紅細胞膜外面的PS顯著增加，細胞生存時間縮短[10]。這些研究結(jié)果證實，腎衰病人體內(nèi)的尿毒素在腎性貧血的發(fā)生機制中占非常重要的地位。血漿中某些因子與CKD病人紅細胞膜表面的PS相關(guān)聯(lián)[11-12]。Mario B等研究表明CKD晚期

5、未透析病人與血液透析病人比較紅細胞膜PS的外露水平?jīng)]有明顯區(qū)別，提示這些毒素不能為透析所清除，進一步研究表明這些因子可能是不耐熱的大分子物質(zhì)或者蛋白質(zhì)，或者是具有高蛋白結(jié)合力的小分子物質(zhì)[12]。
　　各種血液凈化技術(shù)雖然緩解了多種尿毒癥毒素、水電解質(zhì)及酸堿失衡對生命的威脅，但均不能明顯地改善貧血，糾其原因大概是這些透析未能有效清除與蛋白結(jié)合的毒素。硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate，IS)，是一類尿毒癥毒素的典型代表，具

6、有與血漿白蛋白高度結(jié)合能力[13]，其在血漿中的結(jié)合系數(shù)是90％以上[14]，通過常規(guī)透析方法很難清除。CKD3-5期病人血清IS濃度是健康人的50-90倍[15]。近來蛋白結(jié)合尿毒癥毒素IS在CKD病人腎性貧血及其并發(fā)癥中所起的作用逐漸受到人們的關(guān)注。
　　目的:
　　本實驗觀察白蛋白結(jié)合IS作用于紅細胞后的影響、探討其作用機制，從而探究白蛋白結(jié)合尿毒癥毒素IS與CKD病人腎性貧血相關(guān)關(guān)系。
　　方法:
　　本

7、課題按以下內(nèi)容進行探討:
　　本研究采用非吸煙成年健康志愿者的外周靜脈血，以其離心后洗滌紅細胞為研究對象，觀察4％蛋白結(jié)合的IS作用于人紅細胞48h后，檢測其對紅細胞體積(Forward scatter，F(xiàn)SC)、紅細胞外表面PS標記率、溶血率、紅細胞內(nèi)的Ca2+熒光強度的影響。
　　1.采用流式細胞儀檢測4％蛋白結(jié)合IS作用于紅細胞PS標記率和FSC的影響。
　　2.采用酶標儀檢測4％蛋白結(jié)合IS作用于紅細胞溶血率的

8、影響。
　　3.采用流式細胞儀檢測4％蛋白結(jié)合IS作用于紅細胞內(nèi)Ca2+熒光強度的影響。
　　結(jié)果:
　　1.蛋白結(jié)合(62.5、125、250、500、1000)μmol/LIS作用于人紅細胞后，紅細胞FSC分別為1517.33±15.63、1489.66±8.02、1361.00±13.75、877.33±23.02、742.67±14.04,與4％白蛋白組相比，紅細胞體積隨IS濃度的增加而逐漸變小，并呈量效關(guān)系(

9、P＜0.05);而當紅細胞外Ca2+陰性時，隨IS濃度的增加，細胞體積變小的程度明顯減輕。
　　2.蛋白結(jié)合(62.5、125、250、500、1000)μmol/LIS作用于人紅細胞后，紅細胞表面的PS標記率分別為1.51±0.27％、1.73±0.23％、2.99±0.51％、4.78±0.36％、10.32±1.64％，與4％白蛋白組相比，隨蛋白結(jié)合IS濃度的增加，紅細胞外表面的PS標記率漸增加，并呈量效關(guān)系(P＜0.05)

10、;而當紅細胞外Ca2+陰性時，隨IS濃度的增加，紅細胞外表面的PS標記率輕度的增加。
　　3.蛋白結(jié)合(62.5、125、250、500、1000)μmol/LIS作用于人紅細胞后，紅細胞溶血率分別為1.28±0.14％、2.55±0.29％、3.50±0.11％、4.70±0.23％、6.77±0.28％，紅細胞溶血率隨IS濃度的增加而逐漸增加，并呈量效關(guān)系(P＜0.05);細胞外Ca2+陰性時，隨IS濃度的增加，溶血率輕度的增

11、加。
　　4.蛋白結(jié)合(62.5、125、250、500、1000)μmol/LIS作用于人紅細胞后，細胞內(nèi)的Ca2+平均熒光強度分別為6.04±0.70、6.87±0.77、8.72±0.55、9.94±0.47、12.03±0.50，紅細胞內(nèi)的Ca2+平均熒光強度隨IS濃度的增加而緩慢增加，并呈量效關(guān)系(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　4％白蛋白結(jié)合IS增加細胞外表面的PS標記率、溶血率、細胞內(nèi)鈣離子熒光強度，能