家蠶BmVps4和BmVta1功能的初步研究.pdf

1、ESCRT（endosomal sorting complex required for transport）蛋白質復合物廣泛存在于真核生物中，在進化上也是比較保守的，參與胞質分裂、病毒出芽、自噬、質膜損傷的修復、核膜重整、信號轉導調控等多種重要生命活動，與癌癥、神經退行性疾病也有密切關系。ESCRT復合物系統(tǒng)中的一個重要蛋白是ATP酶Vps4，常與其正調控因子Vta1一起，在ESCRT完成功能后負責解離這些復合物以重復利用。目前研究主

2、要在哺乳動物和酵母細胞中進行，在家蠶等昆蟲中的研究還比較少。本論文以Vps4和Vta1在家蠶中的同源基因及編碼蛋白為研究對象，進行了初步的研究，主要結果如下：
　　1.用生物信息學方法，分析家蠶基因組信息，確認了BmVps4、BmVta1的編碼基因（SGD中登錄號分別為BGIBMGA006243、BGIBMGA004694）。BmVps4、BmVta1分別編碼438、311個氨基酸，蛋白相對分子量分別為49 kDa、34 kDa。

3、BmVps4、BmVta1基因分別位于家蠶第6號和22號染色體上。BmVps4蛋白具有保守的MIT結構域、AAA結構域、β片層以及C端螺旋。BmVta1蛋白具有保守的MIT結構域以及VSL結構域。通過序列比對和進化樹分析，發(fā)現(xiàn)BmVps4和BmVta1在進化上也是高度保守的。
　　2.采用PCR法克隆了BmVps4和BmVta1基因，構建大腸桿菌表達載體pET-30a(+)-BmVps4和pET-30a(+)-BmVta1，在大腸

4、桿菌BL21(DE3)中成功表達了BmVps4和BmVta1的重組蛋白。
　　3.用重組蛋白作為抗原免疫小鼠，獲得了分別抗BmVps4和BmVta1的多克隆抗血清，能夠特異性的檢測在大腸桿菌中表達的相應重組蛋白及家蠶內源蛋白，可以用來分析這兩個蛋白在家蠶不同發(fā)育階段及組織器官中的表達情況。
　　4.采用EGFP融合表達的方法，構建基于昆蟲表達載體pIB/V5-His的重組表達質粒pIB-BmVps4-egfp、pIB-egf

5、p-BmVta1，轉染家蠶BmN細胞，用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這2個重組蛋白均主要定位于細胞質中。
　　5.應用熒光定量PCR、RT-PCR及Western blot分析BmVps4和BmVta1在家蠶不同發(fā)育階段及不同組織器官中的基因轉錄和蛋白表達水平的變化。二者的基因在家蠶整個生活周期中均有轉錄，且在胚胎發(fā)育和變態(tài)發(fā)育期達到最高水平；BmVps4在受精卵中轉錄水平最高，是其在1齡幼蟲中表達量的4倍；BmVta1在蠶蛾中轉錄水平最高

6、，是其在1齡幼蟲時的2倍。這兩種蛋白在家蠶生長發(fā)育過程中都有表達，特別在家蠶變態(tài)發(fā)育和胚胎發(fā)育階段有明顯的上調。因此，這兩個基因及其編碼蛋白可能在家蠶發(fā)育中發(fā)揮重要作用。另一方面，這兩個基因具有一定的組織器官表達特異性，在馬氏管、卵巢、精巢、神經節(jié)、頭、脂肪體、中腸、絲腺、血淋巴中均有基因的轉錄，但在頭和血淋巴中基因轉錄水平達到最高。雖然Western blot結果進一步證實了這兩個蛋白在多種組織器官中的廣泛存在，但是二者都在卵巢和精巢

7、中表達量高，在頭部中表達量卻很少，在血淋巴中也沒有檢測到蛋白表達的信號，對這個現(xiàn)象我們正在優(yōu)化實驗條件進行進一步的研究中。
　　6.采用RNAi技術探究BmVps4在家蠶變態(tài)發(fā)育階段的作用。將人工合成的siRNA片段注射進入家蠶5齡第5天幼蟲體內，能夠明顯降低BmVps4的mRNA水平，并顯著的遲滯了變態(tài)發(fā)育的進程。RNA干擾3天后，BmVps4基因的表達量下降了61％，相對于注射si-egfp的陰性對照組家蠶也下降了54%；家蠶

8、體重增長率僅有未注射組家蠶的56%，相當于注射si-egfp家蠶組的60%；化蛹時間也明顯延長，比未注射組延長50分鐘，比注射si-egfp的陰性對照組延長了40分鐘。RNAi處理13天后，蠶蛹的體重和體長均低于對照組家蠶，而且蠶繭明顯變小，繭絲較少。RNAi導致蠶蛾翅膀短小、伸展不開的比例明顯升高，高達30%，是未注射組的3倍，是注射si-egfp組的2倍。這些結果說明BmVps4在家蠶的變態(tài)發(fā)育過程中的確發(fā)揮了重要的作用。
　

9、　7.用家蠶核型多角體病毒BmNPV感染家蠶 BmN細胞，采用熒光定量PCR探索了BmVps4和BmVta1的基因轉錄變化情況。實時熒光定量PCR結果發(fā)現(xiàn)， BmVps4的基因轉錄在病毒侵染后50、60、90分鐘階段有明顯的上調，但在50、60分鐘的上調程度要高于在90分鐘的上調程度；BmVta1則在20、60、90分鐘階段有明顯上調，但在90分鐘的上調程度要高于前2個時間點。這些發(fā)現(xiàn)表明， BmVps4和BmVta1與BmNPV的感染