抑制糖皮質(zhì)激素受體(GR)表達(dá)建立腎陽(yáng)虛小鼠模型.pdf

1、證型是中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。由于腎在臟象學(xué)中居于重要地位，有關(guān)腎陽(yáng)虛證的研究受到極大關(guān)注。為使腎虛證的研究更加客觀可控并具重復(fù)性，近幾十年來(lái)學(xué)術(shù)界一直關(guān)注腎陽(yáng)虛證模型的研究。已有的研究發(fā)現(xiàn)腎陽(yáng)虛患者下丘腦-垂體及其三個(gè)靶腺(腎上腺、甲狀腺、性腺)(Hypothalamic-pituitary-adrenocortical system，HPA)功能紊亂，溫陽(yáng)補(bǔ)腎藥能特異性的提高下丘腦促皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin

2、releasing hormone，CRH)水平，并能改善糖皮質(zhì)激素對(duì)免疫抑制作用。HPA軸及其三個(gè)靶腺功能低下被認(rèn)為是腎陽(yáng)虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)，但HPA軸及其所屬三個(gè)靶腺涉及范圍非常廣泛，為便于臨床診斷和科學(xué)研究，必須找到簡(jiǎn)單易測(cè)的客觀指標(biāo)。研究表明糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)是HPA軸中重要的激素受體，皮質(zhì)醇必須與GR結(jié)合才能發(fā)揮生物效應(yīng)，GR表達(dá)下調(diào)是否是腎陽(yáng)虛證產(chǎn)生的原因之一呢?基于以上研究結(jié)

3、果我們提出以下假設(shè)：GR是腎陽(yáng)虛證的觀察指標(biāo)，抑制GR基因作為腎陽(yáng)虛證的建模方法。
　　 目前抑制基因表達(dá)主要有以下幾種方法：基因敲除、RNA干擾、反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides，AS-ODN)等。敲除動(dòng)物GR基因會(huì)使GR在機(jī)體所有的組織、器官中幾乎完全喪失，動(dòng)物多于出生后隨即死亡，或者胎死腹中，不能模擬腎陽(yáng)虛證發(fā)生時(shí)的自然情況。RNA干擾技術(shù)能部分抑制特定基因表達(dá)，但是目前RNA干擾技術(shù)主要

4、用在細(xì)胞水平抑制特定基因表達(dá)，或者在短時(shí)間內(nèi)抑制動(dòng)物特定基因表達(dá)，不能達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)物水平基因表達(dá)抑制的目的。AS-ODN也是抑制特定基因表達(dá)的手段之一，能達(dá)到較好的特定基因表達(dá)抑制的效果，但其半衰期短，不能用于長(zhǎng)時(shí)期基因表達(dá)抑制。隨著緩釋技術(shù)的發(fā)展，AS-ODN技術(shù)和緩釋技術(shù)結(jié)合后能延長(zhǎng)AS-ODN抑制基因表達(dá)的時(shí)間?？山到饩廴樗嵛⑶蚓褪蔷忈尲夹g(shù)中的一種。是否能將AS-ODN技術(shù)與可降解聚乳酸微球技術(shù)結(jié)合起來(lái)在動(dòng)物水平達(dá)到較好的抑制GR

5、基因表達(dá)的目的?
　　 目的：
　　 1.制備載AS-ODN可降解聚乳酸微球，為建立GR表達(dá)抑制動(dòng)物模型提供基礎(chǔ)。
　　 2.通過(guò)對(duì)三周齡C57小鼠皮下注射不同劑量載AS-ODN可降解聚乳酸微球，找出抑制GR基因表達(dá)效果最好的微球量。
　　 3.觀察GR表達(dá)抑制和腎陽(yáng)虛證的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)GR基因序列并參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)出AS-ODN序列及對(duì)應(yīng)的正義寡核苷酸序列，采用復(fù)乳化

6、法冷凍干燥法制備載AS-ODN可降解聚乳酸微球。觀察微球形態(tài)、載藥率等監(jiān)測(cè)微球質(zhì)量。
　　 2.應(yīng)用不同劑量的載AS-ODN可降解微球皮下注射C57小鼠以建立GR基因敲低的腎陽(yáng)虛小鼠模型，對(duì)該模型采用RT-PCR的方法進(jìn)行鑒定，篩選出有效的用藥劑量，并用該劑量的可降解微球注射作為建立腎陽(yáng)虛小鼠模型的方法。
　　 3.用溫補(bǔ)腎陽(yáng)中藥干預(yù)GR表達(dá)抑制的C57小鼠，然后采用RT-PCR及Westernblot的方法分別驗(yàn)證GR

7、在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況，以此來(lái)觀察溫陽(yáng)補(bǔ)腎中藥是否能提高被抑制的GR表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 通過(guò)復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備載AS-ODN可降解聚乳酸微球，呈白色粉末狀，通過(guò)電鏡觀察其直徑在10～20μm，其外觀圓整。微球載藥量為6.0～11.5μg/mg之間。
　　 建立了GR表達(dá)抑制C57小鼠模型，各個(gè)載AS-ODN可降解微球劑量組GR mRNA在肝、腦、腎上腺中表達(dá)均降低。0.1mg載AS-ODN可

8、降解微球劑量組小鼠肝、腦、腎上腺組織中GRmRNA分別下調(diào)23％～26％，0.2 mg載AS-ODN可降解微球劑量組小鼠肝、腦、腎上腺組織中GRmRNA分別下調(diào)36％～43％，0.4 mg載AS-ODN可降解微球劑量組小鼠肝、腦、腎上腺組織中GRmRNA分別下調(diào)26％～41％，0.8 mg載AS-ODN可降解微球劑量組小鼠肝、腦、腎上腺組織中GRmRNA分別下調(diào)32％～40％。和空白對(duì)照組相比各個(gè)載AS-ODN可降解微球劑量組小鼠GRm

9、RNA表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，且和對(duì)照組相比下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。和對(duì)照組相比，經(jīng)皮下注射載AS-ODN可降解聚乳酸微球一個(gè)月后，小鼠生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，其體重增長(zhǎng)緩慢，并在大體表現(xiàn)上體現(xiàn)出扎堆、豎毛等腎陽(yáng)虛證外在表現(xiàn)，其中0.2mg劑量組小鼠體重增長(zhǎng)最緩慢。
　　 采用載AS-ODN及正義寡核苷酸可降解微球?qū)π∈笃は伦⑸湟恢芎蠓謩e觀察GRmRNA表達(dá)和GR蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，和正義寡核苷酸可降解微球組相比，AS-ODN組小鼠GRmRNA表達(dá)和

10、GR蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。溫補(bǔ)腎陽(yáng)中藥作用于GR表達(dá)抑制的C57小鼠后，GR在mRNA及蛋白水平的表達(dá)有提高作用。在AS-ODN可降解聚乳酸微球皮下注射一周后和對(duì)照組相比安慰劑干預(yù)組GRmRNA下調(diào)39％～41％，補(bǔ)。腎干預(yù)組下調(diào)37％～41％，兩者之間無(wú)明顯差異。
　　 在分別經(jīng)過(guò)安慰劑干預(yù)一月和補(bǔ)腎中藥干預(yù)一月后安慰劑干預(yù)組GRmRNA下調(diào)34％～41％，補(bǔ)腎干預(yù)組GRmRNA下調(diào)10％～25％，經(jīng)補(bǔ)腎干預(yù)后GRmRNA表

11、達(dá)上調(diào)。
　　 在蛋白表達(dá)方面呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。在皮下注射載AS-ODN可降解聚乳酸微球一周后，安慰劑組GR蛋白表達(dá)下調(diào)52％～57％，補(bǔ)腎組GR蛋白表達(dá)下調(diào)54％～61％，在安慰劑干預(yù)一月后GR蛋白下調(diào)52％～61％，在補(bǔ)腎干預(yù)一月后GR蛋白表達(dá)下調(diào)16％～32％。
　　 在分別經(jīng)過(guò)補(bǔ)腎干預(yù)和安慰劑干預(yù)一月后補(bǔ)腎組小鼠體重增長(zhǎng)快于安慰劑干預(yù)組。補(bǔ)腎組抗應(yīng)激能力也相應(yīng)強(qiáng)于安慰劑組小鼠。
　　 結(jié)論：采用皮下注射載