廣西巴馬小型豬hGFAP-DsRed轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的構(gòu)建研究.pdf

1、廣西巴馬小型豬是我國(guó)特有的小型地方豬品種，其體格微小，器官大小及生理特征與人類(lèi)比較接近，是理想的醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GlialFibrillaryAcidicProtein，GFAP)是成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞中間絲的主要成分，并且是該細(xì)胞所特有的成分，因而被廣泛用于星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記。本試驗(yàn)中質(zhì)粒載體hGFAP-DsRed含有一個(gè)人類(lèi)GFAP基因啟動(dòng)子，一個(gè)DsRed編碼序列和一個(gè)博萊霉素抗性基因，它能夠在星形膠質(zhì)細(xì)胞中特異表達(dá)紅

2、色熒光蛋白。hGFAP-DsRed載體在導(dǎo)入成纖維細(xì)胞基因組后不進(jìn)行表達(dá)，而pEGFP-N1載體(含有CMV啟動(dòng)子、GFP基因和新霉素抗性基因)能夠在成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。我們先用pEGFP-N1載體對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，然后在優(yōu)化后的條件下轉(zhuǎn)染并篩選出pEGFP-N1和hGFAP-DsRed轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，待篩選出陽(yáng)性細(xì)胞后，通過(guò)體細(xì)胞核移植的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，為廣西巴馬小型豬轉(zhuǎn)基因克隆的研究打下基礎(chǔ)。
　　 本研究對(duì)細(xì)胞敏感

3、性進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)轉(zhuǎn)染的條件進(jìn)行了優(yōu)化，接著在此基礎(chǔ)上摸索了轉(zhuǎn)基因胚胎的構(gòu)建條件，現(xiàn)將主要結(jié)果歸納如下：
　　 1.分別用G418和Zeocin兩種藥物對(duì)第3代腎臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行了敏感性檢測(cè)，結(jié)果表明：G418濃度為600μg/ml，Zeocin濃度為300μg/ml時(shí)能夠在7天內(nèi)將細(xì)胞全部殺死，由此將轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性克隆篩選的藥物濃度分別定為G418，600μg/ml；Zeocin，300μg/ml。
　　 2.對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)

4、行了優(yōu)化，在脂質(zhì)體量為：1.25μl，質(zhì)粒量(pEGFP-N1)為0.7μg，曝露前脂質(zhì)體-質(zhì)粒室溫孵育時(shí)間為Omin，脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合體曝露時(shí)間為6h時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，為28.05％。
　　 3.在優(yōu)化后轉(zhuǎn)染條件的基礎(chǔ)上，分別用pEGFP-N1，hGFAP-DsRed載體對(duì)腎臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后分別用G418和Zeocin篩選并純化出了三批pEGFP-N1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，四批hGFAP-DsRed轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
　　

5、4.在hGFAP-DsRed轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的囊胚率上：①激活脈沖次數(shù)1pulse組和2pulses組分別顯著(P<0.05)高于3pulses組和4pulses組(29.81％or30.00％vs13.85％，6.48％)，3pulses組顯著高于4pulses組，但1pulse組和2pulses之間差異不顯著；②以PZM-3為培養(yǎng)液獲得的囊胚發(fā)育率顯著高于NCSU-23(28.70％vs12.37％，P<0.05)；③非轉(zhuǎn)基因(K-N

6、T)和轉(zhuǎn)基因(pEGFP-N1-NT，hGFAP-DsRed-NT)組胚胎在囊胚發(fā)育率之間(24.81％vs23.18％or25.37％)無(wú)顯著差異。
　　 總之，在脂質(zhì)體量為1.25μl，質(zhì)粒量(pEGFP-N1)為0.7μg，室溫混勻后立即添加到培養(yǎng)孔內(nèi)并放入培養(yǎng)箱，曝露6小時(shí)即可獲得較高的轉(zhuǎn)染效率；用600μg/ml的(3418，300μg/ml的Zeocin對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行篩選，分別得到了純化的pEGFP-N1，hGFA