基于在線敲出技術(shù)和RTCA分析的龍眼核多酚關(guān)鍵抗氧化功能因子的快速篩選與活性評價.pdf

1、龍眼核中含有大量的活性多酚化合物，在龍眼加工過程中，約占龍眼果鮮重17％的龍眼核被廢棄，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。因此，高效利用龍眼核中的多酚類物質(zhì)是促進(jìn)龍眼高值化綜合利用的有效途徑。但是目前龍眼核多酚中具有強(qiáng)抗氧化作用的關(guān)鍵成分尚不明確，本課題以此為切入點(diǎn)，通過功能組分的在線敲出技術(shù)，結(jié)合體外化學(xué)評價方法，快速篩選出龍眼核中的抗氧化關(guān)鍵成分。采用高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS)、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR-

2、MS）和核磁共振(NMR)等方法對篩選出的抗氧化功能組分中的酚類化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，并在不同的體外化學(xué)和細(xì)胞模型中進(jìn)一步確證了在線篩選方法的可行性。利用微量量熱法和實時細(xì)胞阻抗分析法比較了龍眼核抗氧化關(guān)鍵成分和12種代表性酚類化合物對H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH-3T3氧化損傷的保護(hù)作用，首次建立了基于細(xì)胞微電子阻抗技術(shù)的抗氧化活性成分快速篩選方法。主要研究結(jié)果如下:
　　1.龍眼核多酚的提取及純化
　　采用正交

3、設(shè)計試驗優(yōu)化龍眼核多酚的提取條件。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度為自變量，以龍眼核多酚得率為考察指標(biāo)，經(jīng)過四因素三水平正交試驗得出龍眼核多酚提取的最佳工藝條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)40％、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度70℃、提取時間90min。通過對4種大孔樹脂靜態(tài)吸附及動態(tài)解吸性能的比較，確定D3520型樹脂為龍眼核多酚分離純化的理想樹脂，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為40％時，樹脂對多酚的解吸率最高。

4、　　2.龍眼核抗氧化關(guān)鍵成分的在線篩選
　　采用HPLC在線敲出技術(shù)，結(jié)合FT-ICR-MS和測定還原能力、清除DPPH自由基能力以及氧自由基吸收能力(ORAC)等體外化學(xué)評價方法，篩選出龍眼核中對總抗氧化能力貢獻(xiàn)最大的功能組分2-2及抗氧化功能因子峰4和峰6，而龍眼核多酚的主要成分沒食子酸、以及抗氧化功能組分2-2中的(S)-flavogallonic acid、柯里拉京和沒食子酸乙酯對龍眼核總抗氧化活性的貢獻(xiàn)率則較低。利用HP

5、LC-ESI-MS對抗氧化功能因子峰4和峰6進(jìn)行了初步結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，抗氧化功能因子峰4的結(jié)構(gòu)是未知的，峰6可能為鞣花酸的衍生物。
　　3.龍眼核抗氧化關(guān)鍵成分的結(jié)構(gòu)鑒定及活性確證
　　采用1H-NMR、13C-NMR、二維異核碳?xì)湎嚓P(guān)譜（HMBC）等結(jié)構(gòu)分析手段對在線篩選出的龍眼核抗氧化功能組分的未知結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，首次從龍眼核中鑒定出三種酚類化合物，分別是9-O-(3-羧甲基-4-對甲酰苯乙烯基)羥丁酸（化合物2），

6、2-羥基-3-甲氧基咖啡酸-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（化合物4），3'-O-甲基-4'-O-(4-O-沒食子?；?α-L-吡喃鼠李糖基)鞣花酸（化合物6）。采用水相體系和脂相體系（總抗氧化能力、ORAC、抑制β-胡蘿卜素褪色、抑制黃嘌呤氧化酶活性）證實了新鑒定的化合物4和6的抗氧化能力最強(qiáng)，對總酚抗氧化活性的貢獻(xiàn)最大。選用NIH-3T3細(xì)胞模型進(jìn)一步確證龍眼核關(guān)鍵成分在細(xì)胞生理水平的抗氧化活性，結(jié)果表明，相較于在體外化學(xué)體系中活性較

7、弱的3'-O-甲基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(P7)和沒食子酸乙酯(P8)，抗氧化功能因子2-羥基-3-甲氧基咖啡酸-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(P4)，3'-O-甲基-4'-O（4-O-沒食子酰基-α-L-吡喃鼠李糖基）鞣花酸(P6)在細(xì)胞體系中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化作用，可以有效提高NIH-3T3細(xì)胞抗氧化防御酶SOD、CAT、GSH-Px的活性，降低H2O2誘導(dǎo)的過量活性氧(ROS)水平，緩解線粒體和DNA損傷，抑制細(xì)胞

8、凋亡，保護(hù)細(xì)胞免于受到氧化應(yīng)激的影響。龍眼核抗氧化功能因子在細(xì)胞體系的活性與基于體外化學(xué)評價的活性相關(guān)良好，充分證明了前期在線篩選方法的可行性。
　　4.微量量熱法用于多酚類抗氧化活性篩選的初探
　　為找尋能在細(xì)胞生理水平快速、高效篩選抗氧化功效成分的方法，采用微量量熱法探討了四種龍眼核多酚，2-羥基-3-甲氧基咖啡酸-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(P4)，3'-O-甲基-4'-O-（4-O-沒食子?；?α-L-吡喃鼠李糖基

9、）鞣花酸(P6)，3'-O-甲基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(P7)和沒食子酸乙酯(P8)，對H2O2誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞氧化損傷的影響。實驗從熱化學(xué)角度證實了龍眼核抗氧化功能因子P4和P6對細(xì)胞損傷具有更好的抗氧化修復(fù)作用。但是通過關(guān)聯(lián)生物熱檢測和傳統(tǒng)細(xì)胞檢測的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者的相關(guān)性并不高，推測生物熱動力學(xué)體系可能并不能準(zhǔn)確客觀地反映酚類化合物的抗氧化功效。采用12種具有代表性的已知酚類化合物驗證生物熱模型的可行性，結(jié)果

10、表明，由生物熱動力學(xué)方法得到的化合物的抗氧化活性與前期基于體外化學(xué)實驗得到的結(jié)果存在差異，提示因酚類加入而引起的細(xì)胞代謝產(chǎn)熱的變化并不能準(zhǔn)確反映酚類化合物的抗氧化活性，因此生物熱模型并不適用于抗氧化活性成分的快速篩選及評價。
　　5.建立基于細(xì)胞微電子阻抗技術(shù)的抗氧化活性成分的快速篩選方法
　　采用基于微電子阻抗技術(shù)的實時細(xì)胞分析(RTCA)探討了四種龍眼核多酚(P4、P6、P7、P8)對H2O2誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞氧化

11、損傷的保護(hù)作用。實驗從電化學(xué)角度證實了龍眼核抗氧化功能因子P4和P6對細(xì)胞損傷具有更好的抗氧化修復(fù)效果。通過關(guān)聯(lián)RTCA和傳統(tǒng)細(xì)胞檢測的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者高度相關(guān)，推測基于細(xì)胞響應(yīng)的微電子阻抗變化可以準(zhǔn)確反映酚類化合物對NIH-3T3細(xì)胞損傷的抗氧化修復(fù)作用。采用12種具有代表性的已知多酚類化合物驗證RTCA模型的可行性和適用性，結(jié)果表明，由RTCA體系得到的化合物的抗氧化活性與前期基于體外化學(xué)實驗得到的結(jié)果完全一致，說明RTCA體系的電子