IFN-γ對單核細胞分化、MICs表達的影響以及MICs在單核細胞-NK-T細胞“對話”中的作用.pdf

1、NK細胞及CD8+T細胞分別是天然及適應(yīng)性細胞免疫的主要效應(yīng)細胞?；罨腘K細胞或CD8+T細胞具有相似的效應(yīng)功能：針對靶細胞的細胞毒作用和細胞因子的分泌，其中IFN-γ是活化NK細胞或CD8+T細胞分泌的最常見和最重要的細胞因子。IFN-γ不僅具有直接的抗病毒作用，更能對體內(nèi)多種細胞(包括淋巴細胞自身)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和修飾的作用。 NKG2D是一種表達于NK細胞、巨噬細胞、CD8+T細胞及γδTCR+T細胞表面的活化受體，由NK

2、G2D啟動的信號可直接活化NK細胞和巨噬細胞；對于T細胞，NKG2D提供重要的共刺激信號。MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)分子(MICs)是最早被發(fā)現(xiàn)且研究較充分的NKG2D受體的配體。MICs定位于HLA-Ⅰ類基因區(qū)，在MICA-MICG七個成員中，目前認為MICA及MICB是能夠被轉(zhuǎn)錄翻譯的功能基因。作為一種應(yīng)激的標記分子，MICs廣泛表達于處于熱休克、氧化應(yīng)激、感染及惡變的細胞表面，當它被NK/T細胞表面的NKG2D受體識別并結(jié)合后，即可啟動N

3、K細胞或T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致這些“異?！奔毎磺宄?。MICs分子也低水平表達于正常腸上皮細胞、某些內(nèi)皮細胞及成纖維細胞表面；在單核細胞、某些角質(zhì)細胞及活化的T細胞胞漿內(nèi)，也檢測到MIC蛋白的表達。正常細胞表面低水平或陰性表達MICs分子，可能是機體的一種自我保護機制。 單核細胞是單核-巨噬系統(tǒng)的主要成份。體內(nèi)單核細胞正常情況下處于免疫靜息狀態(tài)，但在適宜的條件作用下，它可以通過轉(zhuǎn)化為DCs或者分泌大量細胞因子來參與或調(diào)節(jié)

4、免疫應(yīng)答。最近研究發(fā)現(xiàn)，單核細胞與NK細胞或T細胞之間存在著對話機制，并且淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-γ及細胞間的直接接觸可能是介導(dǎo)單核細胞與淋巴細胞相互作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但對于IFN-γ在調(diào)節(jié)單核細胞與淋巴細胞之間對話的具體分子機制，目前仍不清楚?？紤]到NKG2D在調(diào)控淋巴細胞活化及其在天然免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間的重要“橋梁”作用，我們猜測NKG2D受體/配體系統(tǒng)極可能也參與了IFN-γ介導(dǎo)的淋巴細胞/單核細胞之間的對話。 雖然HB

5、V特異性T細胞應(yīng)答是機體清除HBV的關(guān)鍵，但NK細胞在HBV感染早期控制病毒復(fù)制及輔助HBV特異性CTLs產(chǎn)生方面也扮演重要角色。HBV慢性感染常常伴有NK細胞數(shù)量和功能的下降，另一方面，慢性乙肝患者對外源性IFN-γ治療呈低反應(yīng)性。HBV慢性感染的NK細胞功能受損是否與單核細胞與NK細胞間交互互作用障礙有關(guān)?IFN-γ對慢性乙肝患者單核細胞是否有正常的免疫調(diào)節(jié)和修飾作用?也是有待回答的問題。 基于以上研究背景和存在問題，本文從

6、以下方面進行了相關(guān)研究： 1、從健康志愿者PBMCs中分選單核細胞，采用流式細胞術(shù)和形態(tài)觀測的方法檢測了細胞因子IFN-γ、FNF-α、IFN-α僅刺激前后單核細胞形態(tài)學變化和有關(guān)表型分子CD14、CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達變化； 2、流式細胞術(shù)檢測細胞因子IFN-γ、TNF-α、IFN-α對正常PBMCs、分選的原代單核細胞以及單核細胞系U937、THP-1表面MIC表達的影響；

7、 3、采用RT-PCR及Westernblot檢測了IFN-γ，刺激前后單核細胞MICs的表達； 4、將IFN-γ刺激的單核細胞與異體NK細胞進行共培養(yǎng)，采用流式細胞術(shù)檢測NK細胞活化標志分子CD69及胞內(nèi)IFN-γ的表達，同時以51Cr釋放試驗分析了NK細胞對其靶細胞K562細胞的細胞毒效應(yīng)，觀察單核細胞表面MICs分子及膜結(jié)合型IL-15(mIL-15)在NK細胞活化及NKG2D受體維持中的作用； 5、采用磁珠活化N

8、K細胞，收集活化NK細胞培養(yǎng)上清，與單核細胞進行培養(yǎng)后，再將單核細胞與自體CD8+CD28-T細胞進行共培養(yǎng)，流式細胞術(shù)檢測單核細胞MICs及T細胞活化相關(guān)分子CD25、CD62L的表達； 6、采用流式細胞術(shù)及51Cr釋放試驗檢測了IFN-γ刺激的慢性乙肝患者單核細胞與正常人NK細胞共培養(yǎng)后，NK細胞的活化分子CD69及胞內(nèi)IFN-γ的表達，以及NK細胞對K562細胞的殺傷能力； 7、流式細胞檢測并比較了IFN-γ刺激后

9、，15例健康志愿者及13例慢性乙肝患者單核細胞表面MICs及mIL-15的表達差異。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、IFN-γ能促進單核細胞粘附聚集，單核細胞簇集形成獨特的“細胞小島”樣結(jié)構(gòu)，IFN-γ刺激的單核細胞呈梭形或多角形，表面有突起形成；IFN-α有較微弱的促進單核細胞簇集的作用，IFN-α刺激的單核細胞形成較多突起，形似星形；TNF-α對單核細胞形態(tài)無明顯影響； 2、IFN-γ刺激5day后，單核細胞同時具有DCs

10、及單核細胞表型特征，體現(xiàn)為由CD14+CD1a-CD83-轉(zhuǎn)變?yōu)镃D14+CD1a+CD83+，但CD14表達水平明顯下降，IFN-γ還能促進單核細胞CD80、CD86及HLA-DR的表達；IFN-α也能促進單核細胞CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表達，能下調(diào)CD14表達，但不能上調(diào)CD1a表達，上調(diào)CD83的能力較弱；TNF-α對上述分子表達無明顯影響； 3、RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示，新鮮分離單

11、核細胞組成性表達MICA及MICB的轉(zhuǎn)錄體和蛋白，流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)單核細胞表面無或微弱地表達MICs分子；用MICs交叉反應(yīng)性抗體行流式細胞檢測，發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以選擇性上調(diào)PBMCs中單核細胞表面MICs表達；以MICA特異性及MICB特異性抗體行流式細胞術(shù)及Westernblot檢測，卻發(fā)現(xiàn)IFN-γ刺激的單核細胞MICA及MICB表達均無明顯上調(diào)，提示IFN-γ可能促進單核細胞某種未知的MIC分子表達；細胞因子TNF-α、IFN-

12、α對單核細胞MICs表達無影響； 4、IFN-γ刺激的單核細胞能促進異體NK細胞CD69及胞內(nèi)IFN-γ表達，能增強NK細胞對K562細胞的殺傷效應(yīng)；單核細胞的這種效應(yīng)至少部分依賴于IFN-γ上調(diào)的MICs分子，因為用抗MICs抗體封閉或用細胞小室阻斷細胞接觸，可以顯著地抑制NK細胞的活化；IFN-γ誘導(dǎo)上調(diào)的mIL-15能保護NK細胞免于MICs誘導(dǎo)的NKG2D受體下調(diào)； 5、活化NK細胞分泌的IFN-γ能促進單核細胞

13、表面MICs及mIL-15表達，單核細胞經(jīng)活化的NK細胞培養(yǎng)上清作用后，能上調(diào)自體CD8+CD28-T細胞CD25表達并下調(diào)CD62L的表達，單核細胞表面上調(diào)表達的mIL-15有助于維持CD8+CD28-T細胞表面NKG2D的正常水平； 6、IFN-γ刺激的慢性乙肝患者單核細胞與正常人NK細胞共培養(yǎng)，不能上調(diào)NK細胞的活化分子CD69及胞內(nèi)IFN-γ的表達，也不能增強NK細胞對K562細胞的殺傷能力；對IFN-γ刺激后，15例健

14、康志愿者及13例慢性乙肝患者單核細胞表面MIC及mIL-15的表達進行流式細胞檢測，發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者單核細胞MICs及mIL-15陽性率低于健康志愿者(分別為21.10％±5.72％vs42.61％±15.39％，及12.77％±4.31％vs28.93％±5.77％)，二者相比有顯著性差異(p＜0.01)。 實驗結(jié)果表明，來源于淋巴細胞的IFN-γ對單核細胞有重要的免疫調(diào)節(jié)和修飾作用。IFN-γ促進單核細胞向成熟DCs分化；I

15、FN-γ選擇性上調(diào)PBMCs中單核細胞mIL-15及某種未知MIC分子(非MICA或MICB)的表達；單核細胞表面上調(diào)的MICs分子能夠刺激NK細胞活化；活化NK細胞分泌的IFN-γ作用于單核細胞后，單核細胞又能依賴MICs分子共刺激CD8+T細胞；單核細胞表面同時上調(diào)表達的mIL-15能夠保護NK細胞或CD8+T細胞免受MICs誘導(dǎo)的NKG2D受體下調(diào)；慢性乙肝患者單核細胞對IFN-γ誘導(dǎo)的MICs及mIL-15上調(diào)存在應(yīng)答缺陷，這可