瘦素對單核細胞向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中ACAT-1表達的影響及其機制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化是與多種危險因素相關(guān)的的動脈慢性炎癥性疾病。其早期的重要病理改變之一是單核細胞在血管內(nèi)皮細胞功能受損時遷移到內(nèi)皮下，分化為巨噬細胞，并且攝取大量脂質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎菽毎谘鼙趦?nèi)是動脈粥樣硬化早期形成脂質(zhì)條紋的主要原因。 泡沫細胞內(nèi)脂滴存在的主要脂質(zhì)是膽固醇酯，它是膽固醇的儲存形式，在脂酰CoA膽固醇酯酰轉(zhuǎn)移酶(ACAT)催化下而產(chǎn)生。當細胞內(nèi)膽固醇達到一定量時，ACAT。將其酯化儲存于細胞內(nèi)，以避免高濃度的膽固

2、醇對細胞產(chǎn)生毒性作用。但在病理條件下，ACAT活性異常升高，使巨噬細胞攝取脂質(zhì)過多促使膽固醇酯大量堆積，對動脈粥樣硬化病變早期泡沫細胞的形成起到關(guān)鍵作用。ACAT有兩種亞型——ACAT-1和ACAT-2，ACAT-1在單核巨噬細胞中是主要的異構(gòu)酶。研究表明，泡沫細胞形成過程中ACAT-1活性明顯上調(diào)。但是迄今為止，導(dǎo)致ACAT活性上調(diào)的機制還不十分清楚，有待于進一步的研究。 瘦素是一種由脂肪細胞分泌的激素，其主要功能為，通過與下

3、丘腦部位的相應(yīng)受體結(jié)合，對機體的食物攝入、能量消耗、脂肪儲存進行中樞性調(diào)節(jié)。瘦素在外周調(diào)節(jié)中同樣起著重要作用，它可以直接調(diào)節(jié)免疫細胞、胰腺B細胞、脂肪細胞和肌細胞。近年來的臨床流行病學(xué)研究認為，高瘦素血癥是動脈粥樣硬化的主要危險因素之一，瘦素是通過與其受體結(jié)合來傳遞調(diào)節(jié)能量代謝信號的，人類的瘦素受體OB-R有5種異形體(isoform)，其中OB-Rb是唯一能進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)能量代謝的異形體。JAK-STAT途徑目前被認為是瘦素信號轉(zhuǎn)

4、導(dǎo)的主要途徑。瘦素除通過上述途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信息外，還可通過活化的Ras蛋白作用于多種靶蛋白，其中最重要的一種是Raf激酶，這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑稱為Ras-Raf-MEK-MAPK途徑，是瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一途徑。 綜上所述，本課題擬采用細胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)技術(shù)進行以下研究： ①單核細胞向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中ACAT-1的表達及活性的變化。 ②瘦素對單核細胞向泡沫細胞分化過程中ACAT-1表達及其活性的影響如何，是否存在劑量

5、或時間依賴效應(yīng)。 ③瘦素對單核細胞向泡沫細胞分化過程中ACAT-1表達及其活性的影響是通過什么樣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 第一部分單核細胞向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中ACAT-1表達及其活性的變化 目的：研究單核細胞向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中ACAT-1表達及活性的變化。 方法： 1.復(fù)蘇、培養(yǎng)人單核細胞株THP-1細胞。 2.單核細胞株THP-1細胞與乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)共孵育1-4天、倒置顯微

6、鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，流式細胞術(shù)檢測誘導(dǎo)后CD14的表達，RT-PCR方法檢測單核細胞分化過程中ACAT-1mRNA表達，Western blotting檢測ACAT-1蛋白表達的變化，液相閃爍計數(shù)法檢測ACAT-1酶活性。 3.巨噬細胞與氧化低密度脂蛋白共孵育1-4天，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，油紅O染色觀察細胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)沉積，RT-PCR方法檢測巨噬細胞分化過程中ACAT-1 mRNA的表達，Western blott

7、ing檢測ACAT-1蛋白表達的變化，液相閃爍計數(shù)法檢測ACAT-1酶活性。 結(jié)果: 1.單核細胞株THP-1細胞復(fù)蘇后呈懸浮生長、增殖，加入PMA誘導(dǎo)48小時后，細胞形態(tài)由圓形變成橢圓形或者不規(guī)則形態(tài)，為貼壁生長形式，體積明顯增大、細胞漿疏松化明顯，細胞器增多、細胞膜周圍可見突起及偽足形成。PMA誘導(dǎo)后，單核細胞株THP-1細胞可表達CD14，陽性率為85.7％，表明單核細胞分化成為巨噬細胞。 2.巨噬細胞經(jīng)o

8、x-LDL誘導(dǎo)24小時后細胞體積進一步增大，為貼壁生長形式，胞漿疏松。油紅O染色胞質(zhì)內(nèi)可見紅染物質(zhì)，表明巨噬細胞分化成為泡沫細胞。 3.在PMA誘導(dǎo)單核細胞株THP-1向巨噬細胞分化過程中，ACAT-1mRNA、蛋白表達及酶活性水平明顯增高，呈時間依賴效應(yīng)，在培養(yǎng)3天后達到最高水平。。 4.在ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細胞向泡沫細胞分化過程中，ACAT-1mRNA、蛋白表達及酶活性水平增高，呈時間依賴效應(yīng)，在培養(yǎng)2天后達到最高

9、水平。但和無血清培養(yǎng)巨噬細胞對照組比較無顯著性差異。 結(jié)論: 1.單核細胞株THP-1經(jīng)PMA和ox-LDL誘導(dǎo)后，可分化為巨噬細胞、泡沫細胞。 2.ACAT-1的表達及活性增高在單核細胞向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中起著重要作用。 第二部分瘦素(Leptin)對單核細胞株THP-1向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中ACAT-1表達及活性的影響 目的：研究瘦素對單核細胞向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中ACAT-1表達及其

10、活性的影響。 方法： 1.復(fù)蘇、培養(yǎng)人單核細胞株THP-1細胞。 2.單核細胞向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中，分別加入不同濃度的瘦素，MTT法測定細胞的存活率，選擇對細胞生長無顯著影響的濃度梯度。 3.單核細胞在PMA誘導(dǎo)下向巨噬細胞分化過程中分別加入1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L和15mmol/L的瘦素共培養(yǎng)1-4天，觀察瘦素對ACAT-1表達和活性影響的時間、劑量效應(yīng)。

11、然后觀察這種影響能否被抗瘦素抗體所拮抗。RT-PCR方法檢測細胞ACAT-1 mRNA表達，Western blotting檢測細胞ACAT-1蛋白水平，液相閃爍計數(shù)法檢測細胞ACAT-1酶活性。 4.巨噬細胞在ox-LDL誘導(dǎo)下向泡沫細胞分化過程中分別加入1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L和15mmol/L的瘦素共培養(yǎng)1-4天，觀察瘦素對ACAT-1表達和活性影響的時間、劑量效應(yīng)。然后觀察這種

12、影響能否被抗瘦素抗體所拮抗。RT-PCR方法檢測細胞ACAT-1 mRNA表達，Western blotting檢測細胞ACAT-1蛋白表達水平，液相閃爍計數(shù)法檢測細胞ACAT-1酶活性。 結(jié)果: 1.15mmol/L以下濃度梯度的瘦素與細胞共培養(yǎng)時對細胞的生長無明顯影響， 20mmol/L瘦素組細胞存活率低于50％。 2.在單核細胞向巨噬細胞的誘導(dǎo)分化過程中，用不同濃度的瘦素干預(yù)后ACAT-1 mRNA、蛋白的

13、表達水平及酶活性增加，呈劑量依賴和時間依賴效應(yīng)，當瘦素為10mmol/L培養(yǎng)時間達3天時上調(diào)作用最明顯， ACAT-1的表達水平約為對照組的2倍。該上調(diào)作用能被抗瘦素抗體完全拮抗。 3.在巨噬細胞向泡沫細胞的誘導(dǎo)分化過程中，用不同濃度的Leptin干預(yù)后細胞中ACAT-1 mRNA、蛋白的表達水平及酶活性增加，呈劑量依賴和時間依賴效應(yīng)，當Leptin為10mmol/L培養(yǎng)時間達2天時上調(diào)作用最明顯，ACAT-1的表達水平約為對照

14、組的1.5倍。該上調(diào)作用能被抗瘦素抗體完全拮抗。 結(jié)論: 1.瘦素可以上調(diào)單核細胞向巨噬細胞、巨噬細胞向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中ACAT-1的活性。并呈時間、劑量依賴效應(yīng)。 2.瘦素對單核細胞向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中ACAT-1活性的影響是通過上調(diào)其轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后蛋白表達水平而實現(xiàn)的。 第三部分瘦素影響單核細胞向泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中ACAT-1表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究 目的:研究瘦素上調(diào)單核細胞向泡沫

15、細胞誘導(dǎo)分化過程中ACAT-1表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 方法:復(fù)蘇、培養(yǎng)人單核細胞株THP-1細胞，并分別向巨噬細胞、泡沫細胞方向誘導(dǎo)分化。 1.在單核細胞誘導(dǎo)分化為巨噬細胞和巨噬細胞分化為泡沫細胞后，分別測定細胞中瘦素受體OB-Rb的蛋白表達水平。 2.在單核細胞與PMA、瘦素共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，分別加入Raf抑制劑、JAK激酶抑制劑、STAT3抑制劑、MAPK抑制劑干預(yù)，觀察各抑制劑對瘦素上調(diào)ACAT-1表達水平的影

16、響。RT-PCR方法檢測細胞ACAT-1mRNA表達，Western blotting檢測細胞ACAT-1蛋白水平，液相閃爍計數(shù)法檢測細胞ACAT-1酶活性。 3.在巨噬細胞與OX-LDL、瘦素共培養(yǎng)基礎(chǔ)上，分別加入Raf抑制劑、JAK激酶抑制劑、STAT3抑制劑、MAPK抑制劑干預(yù)，觀察各抑制劑對瘦素上調(diào)細胞ACAT-1表達水平的影響。RT-PCR方法檢測細胞ACAT-1 mRNA表達，Western blotting檢測細胞

17、ACAT-1蛋白水平，液相閃爍計數(shù)法檢測細胞ACAT-1酶活性。 結(jié)果: 1.在瘦素干預(yù)下單核細胞向巨噬細胞、泡沫細胞誘導(dǎo)分化過程中，瘦素受體OB-Rb表達增高，與單核細胞比較有顯著性差異，但巨噬細胞和泡沫細胞之間無顯著性差異。 2.在單核細胞向巨噬細胞分化過程中，瘦素對ACAT-1表達的上調(diào)作用可以分別被JAK激酶抑制劑、STAT3抑制劑大部阻斷；Raf抑制劑、MAPK抑制劑部分阻斷。 3.在巨噬細胞向