TGF-β1誘導的腎小管上皮-間質細胞轉分化模型的建立.pdf

1、背景和目的:上皮細胞-間充質細胞轉分化(epithelialtomesenchymaltransition,EMT)是一種分化完全的上皮細胞丟失其原有的表型而轉變?yōu)殚g質細胞的一種特殊的生理病理過程,受多種細胞因子、生長因子和激素的調節(jié),其分子機制尚不明確。研究發(fā)現,腎小管上皮細胞發(fā)生EMT在腎臟纖維化的發(fā)展中起著重要作用,可能是腎間質纖維化(RIF)發(fā)生發(fā)展的重要機制。RIF是多種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同途徑。轉化生長因子β

2、1(tansforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)是目前發(fā)現的最強的促纖維化因子,能夠誘導胚胎發(fā)育、組織纖維化和腫瘤的發(fā)生中的EMT。腎小管上皮細胞轉分化(renaltubularepithelialcelltransdifferentiation,TEMT)是一個可逆的有序的發(fā)生過程,TGF-β1誘導的TEMT最早改變就是抑制E-cadherin表達,E-cadherin的降低或不表達已成為細胞轉分化的標志。因此

3、,EMT以細胞和分子變化為特征,包括細胞間黏連和細胞極性的消失涉及黏著連接、緊密連接及細胞橋粒;上皮細胞角蛋白的下調;間質蛋白的上調如波形蛋白(VIM),在某些情況下還有平滑肌肌動蛋白(ACTA2);為形成紡錘狀細胞形態(tài)的細胞骨架重構;涉及動態(tài)的肌動蛋白微絲的細胞運動和侵襲能力的增加;抗凋亡能力的增加。為了開展EMT發(fā)生的分子機制研究,探討TGF-β1在人腎小管上皮細胞中促轉分化的作用,擬建立基于腎小管上皮細胞-間質細胞轉分化(TEMT

4、)細胞模型。方法:1.根據GenBank數據庫提供的基因序列,使用在線Primer-BLAST引物設計軟件設計引物。采用RT-PCR方法檢測E-cadherin的表達變化,優(yōu)化TGF-β1作用濃度和作用時間。2.將實驗分為正常對照組和TGF-β1處理組,利用TGF-β1(10ng/ml)處理實驗組人腎小管上皮細胞(HK-2)24h,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。3.RealtimeRT-PCR、Westernblot和細胞免疫熒光檢測檢測E

5、MT相關的分子標記。4.劃痕實驗和Transwellassay檢測細胞遷移及侵襲能力。結果:1.成功設計PCR引物,根據E-cadherin基因表達,優(yōu)化后得到TEMT中最佳時間點和濃度為TGF-β1(10ng/ml,24h)。2.構建TGF-β1誘導的EMT體外細胞培養(yǎng)模型,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài):正常對照組細胞呈鵝卵石樣形態(tài);TGF-β1(10ng/ml)處理后細胞呈細長狀,細胞間緊密連接降低。3.RealtimeRT-PCR檢測

6、:TGF-β1處理組E-cadherin的表達水平降低,β-catenin的表達上調。Westernblot和免疫熒光檢測:TGF-β1處理組E-cadherin表達減低,Vimentin表達增強。4.劃痕和Transwellassay法檢測:TGF-β1處理組細胞的遷移及侵襲能力明顯增強。結論:1.E-cadherin、Vimentin和β-catenin、細胞遷移及侵襲能力是細胞轉分化的分子標志和特征。2.驗證了TGF-β1在腎小管