高糖誘導人腎小管上皮細胞轉分化及ILK的表達.pdf

1、研究背景：腎小管問質病變是糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)進展為終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的重要病理基礎，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在腎間質過量堆積是其基本病理特征。目前認為腎間質ECM主要由肌成纖維細胞(myofibroblast，MyoF)分泌。研究發(fā)現在病理條件下，腎小管上皮細胞可發(fā)生小管上皮細胞．肌成纖維細胞轉分化(t

2、uLbular epithelial-myofibroblast transdifferentiation，TEMT)，即喪失原有的上皮細胞表型特征，而獲得MyoF的新特征，是腎間質MyoF的重要來源。眾多體內及體外實驗表明TEMT參與了許多慢性腎臟疾病腎間質纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本課題組前期動物實驗研究證實糖尿病大鼠腎小管間質纖維化過程中存在TEMT，但是體外高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞是否發(fā)生轉分化?目前尚不十分清楚。 轉化生長因

3、子-β1(tansforming growth factor beta-1，TGF-β1)是TEMT的重要啟動和促進因子。TGF-β1的生物學作用廣泛而復雜，具有正面和負面的多樣效應。單純抑制TGF-β1這一上游因子，則可能在抑制TEMT的同時引起其他不利的負效應。于是，尋找作用更特異、有效的下游因子或環(huán)節(jié)，成為新近研究的關注熱點。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是1996年發(fā)現的一種細胞內絲氨酸/

4、蘇氨酸蛋白激酶，具多功能蛋白激酶活性。ILK作為是TGF-β1下游重要的效應分子，在TEMT過程中起重要作用，是TEMT關鍵調節(jié)因子之一。 ILK也是細胞外FN(fibronectin，FN)積聚的重要調節(jié)因子。本課題組前期動物實驗研究證實糖尿病大鼠腎小管上皮細胞ILK表達增高，且隨病程進展而遞增，但是體外高糖環(huán)境下人腎小管上皮細胞ILK表達如何?目前國內外未見文獻報道。目的：以高糖模擬糖尿病條件，體外觀察高糖環(huán)境下人近端腎小管

5、上皮細胞(HK-2)是否發(fā)生TEMT及ILK的表達變化，探討ILK在TEMT中的意義及機制。 方法：應用細胞培養(yǎng)技術，按下列實驗條件分組培養(yǎng)人近端腎小管上皮細胞(HK-2)：正常對照組(N組)用低糖(5.5mM D-葡萄糖)培養(yǎng)液；高糖組(H組)用高糖(30mM D-葡萄糖)培養(yǎng)液；甘露醇組(M組)用含24.5mM D-甘露醇+5.5mM D-葡萄糖的培養(yǎng)液(滲透壓與高糖組相近)。三組均在無血清條件下培養(yǎng)，分別在實驗作用的0h，

6、12h，24h，48h，72h收集細胞并提取細胞總蛋白，各組實驗均重復3次。倒置相差顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)，Western Blotting方法檢測HK-2中α-SMA、 E-cadherin、ILK及FN的蛋白表達水平的時間效應。 結果：1．N組和M組各時間點HK-2細胞E-cadherin表達均較強，各個時間點之間變化無明顯差異(P>0.05)；H組E-cadherin表達隨時間延長而表達減弱，72h表達最弱，呈時間依賴性

7、(P<0.05)。2.N組和M組各時間點HK-2細胞幾乎無α-SMA表達，FN表達很弱，各個時間點之間無明顯差異(P>0.05)；H組α-SMA及FN表達隨時間延長而表達增加，72h達高峰，呈時間依賴性(P<0.05)。3.N組和M組各時間點HK-2細胞ILK表達微弱，各個時間點之間無明顯差異(P>0.05)；H組ILK表達隨時間延長而表達增加，72h達高峰，呈時間依賴性(P<0.05)。各時間點HK-2細胞中，ILK與E-cadher

8、in的蛋白表達量成負相關(r=-0.85，P<0.01)：ILK與α-SMA和FN的蛋白表達量成正相關(r=0.84，P<0.01；r=0.93，P<0.01)。 結論：1．高糖環(huán)境下，體外培養(yǎng)的HK-2細胞E-cadherin表達減少，α-SMA、FN表達增加，表明在體外高糖獨立因素能誘導人腎小管上皮細胞轉分化。2．高糖環(huán)境下，HK-2細胞ILK表達上調，并與E-cadherin變化呈負相關，與α-SMA、FN變化呈正相關；I