Notch與NF-κB信號通路的串話在乙肝相關性肝癌發(fā)生中的作用.pdf

1、目的:
　　 1.構建穩(wěn)定表達HBx的轉(zhuǎn)基因細胞模型L02/HBx細胞。
　　 2.檢測L02/HBx細胞中，HBx 蛋白與Notch 及NF-κB的結合能力，研究HBx蛋白對Notch與NF-κB 信號通路的作用方式與機制，從信號通路這一角度探討HBx在肝細胞癌發(fā)生機制中的作用。
　　 3.檢測L02/HBx細胞中Notch 信號通路阻斷后，NF-κB的功能亞基p50、p65及抑制因子IκBαmRNA與蛋白表達

2、的改變，同時檢測NF-κB DNA結合活性的變化，探討Notch與NF-κB 信號通路在L02/HBx細胞中的串話作用機制及其在肝細胞惡性轉(zhuǎn)化及乙肝相關性肝癌發(fā)生中的作用。
　　 方法:
　　 1.傳代培養(yǎng)由課題組林松挺前期構建的穩(wěn)定表達HBx的轉(zhuǎn)基因細胞模型L02/HBx細胞。
　　 2.應用免疫共沉淀法檢測轉(zhuǎn)基因細胞株L02/HBx細胞中HBx 蛋白與Notch1(NICD、Jagged1)及NF-κB (p

3、50、p65、IκBα)的結合能力，同時采用細胞免疫熒光技術和激光共聚焦顯微鏡測定L02/HBx細胞中HBx與NICD 兩種蛋白的共定位情況。
　　 3.應用含有20μM DAPT的DMEM 培養(yǎng)L02/HBx細胞48h（DAPT組），阻斷Notch 信號通路，以含有0.05％DMSO的DMEM 培養(yǎng)L02/HBx細胞48h（DMSO組）及普通DMEM 培養(yǎng)的L02/HBx細胞作為對照組，并應用免疫印記法檢測這三組細胞中NICD

4、 蛋白量的改變。
　　 4.應用凝膠遷移率實驗檢測NF-κB的DNA結合活性在DAPT組、DMSO組、L02/HBx組三組細胞中的改變。
　　 5.應用RT-實時PCR定量檢測NF-κB (p50、p65、IκBα)mRNA在DAPT組及對照細胞DMSO組、L02/HBx組細胞中的表達；同時應用免疫印記法檢測這三組細胞中p50、p65蛋白在胞漿和胞核中的變化及IκBα總蛋白的改變。
　　 結果:
　　 1

5、.免疫共沉淀和免疫熒光試驗發(fā)現(xiàn)L02/HBx細胞中HBx 蛋白可與NICD 結合，而不能與Jagged1、p50、p65及IκBα結合。
　　 2.應用免疫印記法測定L02/HBx+DAPT（DAPT組）、L02/HBx+DMSO（DMSO組）、L02/HBx組三組細胞中NICD的蛋白含量，結果顯示與對照組細胞相比DAPT組細胞中NICD的蛋白含量顯著降低，而對照組DMSO與L02/HBx細胞中NICD的蛋白含量無顯著差異。

6、r>　　 3.凝膠遷移率實驗檢測NF-κB的DNA結合活性，結果顯示與對照組細胞相比DAPT組細胞中NF-κB的DNA結合活性顯著降低，而對照組DMSO組與L02/HBx組細胞中NF-κB的DNA結合活性無明顯差異。
　　 4.實時定量PCR定量檢測發(fā)現(xiàn)NF-κB 功能亞基p65mRNA在DAPT組（0.466667±0.027285）細胞中的表達顯著低于DMSO組（0.97±0.045092）和L02/HBx（1±0.049

7、329）細胞(p<0.01)；NF-κB 功能亞基p50 mRNA在DAPT組（0.43±0.01）細胞中的表達顯著低于DMSO組（1.01±0.01）和L02/HBx（1±0.04）細胞(p<0.01)；相反NF-κB 抑制因子IκBαmRNA在DAPT組（1.38±0.025166）細胞中的表達顯著高于DMSO組（1.006667±0.012019）和L02/HBx（0.995±0.095）細胞(p<0.01)；p50、p65及Iκ

8、BαmRNA 各自在兩組對照細胞中無顯著差異。
　　 5.免疫印記法測定各組細胞中的p50、p65及IκBα的蛋白含量，結果顯示與對照細胞相比DAPT組細胞中，p50 及p65蛋白在胞核中的含量顯著降低，而在胞漿中無顯著差異；IκBα總蛋白含量則顯著升高；p50和p65蛋白含量在兩組對照細胞胞漿及胞核中及 IκBα含量在兩組對照細胞總蛋白中均無顯著差異。
　　 結論:
　　 1.HBx蛋白可與Notch受體胞內(nèi)段

9、NICD 直接結合，而不與其配體Jagged1結合，這種直接結合作用可激活Notch信號通路；
　　 2.Notch1信號通路的激活可以在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)NF-κB 功能亞基p50、p65的表達，下調(diào)NF-κB抑制因子IκBα的表達，促進p50、p65蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，還可增加核蛋白NF-κB的DNA結合活性，引起下游一系列基因的活化；
　　 3.HBx不能通過與p50、p65或IκBα的結合參與NF-κB 信號通路的調(diào)控，