抗棗瘋病相關蛋白的雙向電泳分析.pdf

1、棗(Ziziphus jujuba Mill.)是我國重要的特色和優(yōu)勢果樹樹種。棗瘋病是由植原體(Phytoplasma)引起的致死性傳染病害，對棗產業(yè)危害極大。本課題組最近在國內外首次選育出了高抗棗瘋病新品種“星光”，為揭示其抗病機制，本研究利用雙向電泳和質譜分析技術，對其在植原體侵染前后不同時期的蛋白進行了蛋白質組學分析，旨在尋找抗棗瘋病相關蛋白，進而通過氨基酸序列預測基因序列，為抗病基因克隆奠定基礎。主要結果如下: l建立

2、了棗韌皮部蛋白的雙向電泳體系本試驗通過對TCA-丙酮法和甲醇/醋酸銨法的比較，確定甲醇/醋酸銨法適宜棗韌皮部總蛋白提取，可解決棗枝皮中多糖、色素等對雙向電泳的干擾問題。 適宜的蛋白上樣量為380μL(約200 ug)，最佳平衡時間為30min～40min，第二向SDS-PAGE電泳的最佳電泳值為200V；通過考馬斯亮藍和硝酸銀染色方法的比較，確定了硝酸銀染色適宜于棗韌皮部蛋白染色。 確定了棗韌皮部蛋白主要集中在pI4～7

3、之間。利用本試驗建立的蛋白質提取及雙向電泳體系，對棗韌皮部蛋白采用pH4～7的線性IPG膠條進行分離，經硝酸銀染色后獲得了重復性好、分辨率高的蛋白質雙向電泳圖譜，經PDQuest圖像分析軟件處理，得到500～700個可識別的蛋白質斑點。 2棗瘋病抗性相關蛋白分析通過單向電泳分析，發(fā)現(xiàn)在棗瘋病病樹上嫁接的“星光”接穗與健康樹上相比，在70d、90d時沒有明顯差異，而在嫁接后110d時，有三條譜帶(分子量為31.2 kDa、30.4

4、 kDa、29.0 kDa)表達量顯著增加。 通過雙向電泳和蛋白斑點比對分析，發(fā)現(xiàn)棗瘋病病樹上嫁接的“星光”接穗在嫁接后90d及110d時，在酸性端出現(xiàn)一隨發(fā)育階段后延而表達增強的區(qū)域(分子量27～32KD、等電點pI4.2～5.0)，在對照健康樹上嫁接的接穗均沒有此變化。此結果與單向電泳結果一致。 確定了與棗瘋病抗性相關的蛋白范圍為分子量27～32KD、等電點pI4.2～5.0。 3獲得了3個同源性較好的蛋白序