甘藍型油菜種子萌發(fā)時期油體蛋白雙向電泳分析.pdf

1、油體是植物儲存油脂的一種亞細胞結構，其中心部分是由三酰甘油組成的半透明基質，外層包裹磷脂單分子層，其中鑲嵌多種油體結合蛋白。油體結合蛋白在油體的發(fā)生和富集、穩(wěn)定和降解、信號轉導、蛋白和脂類轉運等過程中起到非常重要的作用。前人對于植物油體及油體蛋白的研究局限于靜態(tài)研究方面，對于油體降解的動態(tài)過程研究較少。因此，利用蛋白質組學技術對萌發(fā)時期油體進行差異蛋白質組學分析有助于進一步解析油體降解過程中油體蛋白的組分、修飾狀態(tài)等變化規(guī)律，這對于深入

2、了解油體降解的分子機理以及探究油體相關蛋白的結構與功能具有重要意義。
　　本研究以甘藍型油菜種子鼎油雜4號為實驗材料，對萌發(fā)時期油菜種子油體形態(tài)變化、生理指標等進行了研究，同時采用雙向電泳的方法對萌發(fā)過程中油體蛋白的變化規(guī)律及表達情況進行分析探究，為本實驗室后續(xù)開展的油菜種子萌發(fā)時期具有穩(wěn)定差異表達規(guī)律的油體蛋白質質譜鑒定以及油體降解的分子機理研究奠定基礎。主要研究結果如下:
　　(1)建立了油菜種子油體熒光顯微觀察方法，探

3、索了種子萌發(fā)過程中油體形態(tài)變化規(guī)律;確定了油體蛋白雙向電泳研究的取樣時間。采用石蠟切片方法結合尼羅紅染色對甘藍型油菜種子萌發(fā)過程中油體形態(tài)進行觀察，結果顯示:油體的降解主要發(fā)生在24小時之后，其中24-36小時之間油體降解幅度較大。綜合油菜種子萌發(fā)時期生理研究及油體形態(tài)變化規(guī)律，將油體蛋白雙向電泳研究的取樣時間確定為0h、24h、36h、48h四個時間點。
　　(2)優(yōu)化了油體提取方法，獲得較高純度的油體;探索了環(huán)境因素對油體穩(wěn)定

4、性的影響，結果顯示pH和離子濃度對油體的穩(wěn)定性影響較大，溫度對油體的穩(wěn)定性影響較小。在原有提取油體的基礎上增加9M尿素洗脫和正己烷萃取等步驟，獲得了較高純度的油體，鏡檢結果顯示油體平均直徑為2.19μm。綜合溫度、pH、離子濃度等環(huán)境因素研究了不同環(huán)境條件對油體穩(wěn)定性的影響，結果顯示:在pH4-6之間油體穩(wěn)定性明顯下降，油體直徑明顯增大，pH值為5時油體直徑達到最大值5.5μm為對照的228％;隨著離子濃度的增加油體穩(wěn)定性下降，油體直徑

5、持續(xù)增加，當NaCL濃度增加至250mM時油體直徑達到5.62μm為對照的257％;溫度對油體穩(wěn)定性幾乎無影響，不同溫度下油體平均直徑為2.33μm。
　　(3)優(yōu)化了甘藍型油菜種子油體蛋白雙向電泳體系(two-dimensionalgelelectrophoresis，2D-PAGE)。通過純化油體并在實驗室已有提取蛋白方法的基礎上提取萌發(fā)時期油菜種子油體蛋白;選取60mMTris裂解液(7MUrea，2M硫脲，4％CHAPS，

6、2％兩性電解質pH3-10，2％DTT，60mMTris)裂解蛋白干粉;確定油體蛋白雙向電泳凝膠的最佳染色方法為硝酸銀染色法。
　　(4)利用優(yōu)化的管狀凝膠雙向電泳體系，對萌發(fā)時期油菜種子油體蛋白進行雙向電泳分析，獲得分離效果較好的差異蛋白表達圖譜。圖譜分析表明:差異蛋白穩(wěn)定表達，圖譜重復性較好，萌發(fā)過程中油體蛋白圖譜整體相關系數(shù)為0.706021;四張圖譜整體匹配出117個蛋白點，其中在0-24h、24-36h、36-48h之間