池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)及其與益生菌調(diào)控的關(guān)系.pdf

1、本研究從微生態(tài)角度出發(fā)，對(duì)池塘養(yǎng)殖牙鮮 olivaceus)腸道菌群結(jié)構(gòu)及其影響因素進(jìn)行了初步分析，同時(shí)向養(yǎng)殖池塘環(huán)境中添加微生態(tài)制劑，探索了微生態(tài)制劑對(duì)池塘環(huán)境的改變及養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群的應(yīng)答變化，以期為今后牙鲆池塘養(yǎng)殖專用微生態(tài)制劑的研制和養(yǎng)殖環(huán)境微生態(tài)調(diào)控技術(shù)構(gòu)建提供理論依據(jù)，同時(shí)有利于建立池塘養(yǎng)殖牙鲆健康生長(zhǎng)調(diào)控技術(shù)。本研究主要包括三個(gè)部分:工廠化和池塘養(yǎng)殖模式下牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)的比較分析、益生菌的分離培養(yǎng)及其水質(zhì)調(diào)控效果評(píng)價(jià)、池

2、塘環(huán)境及養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群對(duì)益生菌調(diào)控的響應(yīng)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、工廠化和池塘養(yǎng)殖模式下牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)的比較分析
　　為比較池塘和工廠化養(yǎng)殖條件下牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)差異及其與餌料、水環(huán)境、底質(zhì)等的關(guān)系，采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析手段，構(gòu)建了牙鲆腸道、養(yǎng)殖水體、餌料和池塘底泥等7個(gè)樣品的16s rRNA基因測(cè)序文庫(kù)，分析了不同樣品中菌群組成和生物多樣性。結(jié)果表明：池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道（B1)中以厚壁菌門（3

3、0.49％)、變形菌門（19.16%)和梭桿菌門（11.11%)為主，其中芽孢桿菌屬（27.66%)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，弧菌屬（0.16%)豐度最??；工廠化養(yǎng)殖牙鲆腸道（B5)中以變形菌門（44.31%)、厚壁菌門（11.57%)和放線菌門（4.79%)為主，其中不動(dòng)桿菌屬（10.37%)豐度最大，弧菌屬（4.05%)相對(duì)B1中豐度較高。牙鲆腸道優(yōu)勢(shì)菌群主要與營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)相關(guān)，同時(shí)有益微生物和有害微生物也是腸道菌群的重要組成部分。差異性和系統(tǒng)進(jìn)

4、化分析表明兩種養(yǎng)殖條件下牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)與餌料中菌群關(guān)系密切，此外受養(yǎng)殖水環(huán)境中菌群影響較大。池塘養(yǎng)殖模式下牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)受底質(zhì)影響相對(duì)較小。
　　2、兩株益生菌的分離培養(yǎng)及水質(zhì)調(diào)控效果評(píng)價(jià)
　　篩選了一種微生態(tài)制劑，具有較好的養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控效果。為進(jìn)一步鑒定其有效成分，綜合利用基于細(xì)菌16S rRNA基因文庫(kù)的Miseq高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)分析方法、細(xì)菌純化培養(yǎng)技術(shù)等手段，認(rèn)識(shí)了該種微生態(tài)制劑的菌群組成，對(duì)可培養(yǎng)的兩

5、株優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行分離純化，探明了其生理生化特性，鑒定了其分類地位，摸清了適宜的培養(yǎng)條件，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)室條件下的水質(zhì)處理效果，為下一步益生菌的分離純化和生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：該微生態(tài)制劑中主要的菌群包括腸桿菌屬（31.99%)、芽孢乳桿菌屬（31.81%)、乳桿菌屬（15.8%)、芽孢桿菌屬（1.44%)等，另有18.96%的細(xì)菌尚未分類。經(jīng)分離純化，培養(yǎng)基篩選、形態(tài)學(xué)鑒別、生理生化反應(yīng)、分子生物學(xué)鑒定，得到植物乳桿菌A、芽孢桿菌

6、B兩株有益菌。在實(shí)驗(yàn)室條件下摸索兩株菌的最適生長(zhǎng)條件，結(jié)果顯示：植物乳桿菌A、芽孢桿菌B的最適生長(zhǎng)p H分別為6.5、6.0，最適生長(zhǎng)溫度分別為30℃、36℃。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下評(píng)價(jià)其水質(zhì)調(diào)控能力，采用水楊酸鹽法、重氮化作用法、PhodVer3抗壞血酸法分別驗(yàn)證其對(duì)氨氮、亞硝酸鹽、磷酸鹽的降解能力。結(jié)果表明：植物乳桿菌A(OD600nm=2.33)、芽孢桿菌B(OD600nm=2.23)培養(yǎng)達(dá)到最大密度時(shí)，按照10:1混合使用凈化水質(zhì)效

7、果最好，對(duì)水體中氨氮、亞硝酸鹽、磷酸鹽的降解率分別達(dá)到了73.1%、57.8%、52.4%。
　　3、池塘環(huán)境及養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群對(duì)益生菌調(diào)控的響應(yīng)
　　為評(píng)價(jià)一種微生態(tài)制劑對(duì)池塘養(yǎng)殖水環(huán)境及養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群的調(diào)控效果，采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析手段，構(gòu)建了牙鲆腸道、養(yǎng)殖水體、餌料和池塘底泥等4批次22個(gè)樣品的16s rRNA基因測(cè)序文庫(kù)，分析了不同樣品中菌群組成和生物多樣性在微生態(tài)制劑調(diào)控過程中的變化趨勢(shì)。

8、結(jié)果表明，試驗(yàn)期間，微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中氨氮降解率最高達(dá)到88.9%;亞硝酸鹽含量降解率最高達(dá)到67.9%，磷酸鹽降解率最高達(dá)到69%。另一方面，池塘水體中葉綠素含量增加了19.05%，擬桿菌門菌群呈增加趨勢(shì)，變形菌門呈下降趨勢(shì)；底泥中芽孢桿菌屬變化最為明顯，由最初的3.78%增加到33.64%。牙鲆腸道中腸桿菌屬、軍團(tuán)桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬均有不同程度的增加，弧菌屬相對(duì)豐度由最初的0.16%降低到0.05%。另外，還在牙鲆腸道內(nèi)檢測(cè)到植