水稻應答稻縱卷葉螟取食和MeJA處理的基因差異表達分析與驗證.pdf

1、本研究利用cDNA-AFLP技術、消減文庫的構建進行水稻應答稻縱卷葉螟取食的基因表達譜或基因差異展示研究，并利用實時熒光定量PCR．技術對部分重要候選基因差異表達進行驗證，選取一個重要的候選基因構建了其超表達載體，主要研究結果如下： 1、水稻應答稻縱卷葉螟取食和MeJA處理轉錄譜的cDNA-AFLP分析。 使用16對引物組合對應答稻縱卷葉螟取食和MeJA處理的水稻進行轉錄譜的cDNA-AFLP分析，共獲得約12000 T

2、DFs。選取差異明顯的240條TDFs測序，197個找到對應的基因序列。得到164個不重復的差異TDFs，其中，154個TDFs在稻縱卷葉螟取食作用下表達發(fā)生改變，94個發(fā)生上調，它們對應的基因主要有生長素輸出載體家族蛋白、伴侶蛋白、早期應答脫水蛋白、PHD鋅指蛋白等，60個發(fā)生下調，它們對應的主要基因有RNA聚合酶bern亞基2、類枯草桿菌蛋白酶、熱激蛋白等；119個TDFs在外源MeJA作用下表達發(fā)生改變，其中70個TDFs發(fā)生上調

3、，它們對應的基因主要有RNA聚合酶beta亞基2、PHD鋅指蛋白、病程相關蛋白5前體、NB-ARC結構域蛋白、鐵氧還蛋白以及早期應答脫水蛋白等，49個發(fā)生下調，它們對應的基因主要有生長素輸出載體家族蛋白、熱激蛋白等。在水稻葉片接種稻縱卷葉螟幼蟲2h后，就發(fā)現68個差異表達的TDF，對應的是水稻早期應答稻縱卷葉螟取食的基因。在稻縱卷葉螟取食和外源MeJA作用下，發(fā)現水稻葉片中有42個TDFs共同上調，它們主要有PHD鋅指蛋白、生長素抑制蛋

4、白、早期應答脫水蛋白等，12個TDFs共同下調，它們主要有類脯氨酰羧肽酶蛋白、核酮糖磷酸鹽羧化酶主鏈蛋白前體、熱激蛋白等。 2、構建了水稻響應稻縱卷葉螟取食的抑制消減文庫。SSH文庫是一種簡便而高效的差異表達基因篩選技術，該技術通過兩輪差減雜交和兩次抑制性PCR，使差異表達基因得到有效的富集并得以克隆，在分離克隆差異表達基因的應用上表現出了獨特的優(yōu)越性。從中挑取135個克隆進行PCR擴增并測序，得到33個不重復的差異表達基因的c

5、DNA克隆，其中有13個cDNA克隆與cDNA-AFLP的結果相一致，如生長素抑制蛋白、丙胺酸轉移酶、光誘導蛋白及NAC轉錄因子等。 3、應用熒光定量技術對水稻應答稻縱卷葉螟取食的4個TDFs對應的基因表達進行檢測。結果表明，與TDF501對應的PP2C基因、與TDF518對應的膜關聯鹽脅迫蛋白基因和與TDF974對應的PHD鋅指蛋白基因等在稻縱卷葉螟取食2h后開始表達，6h大量表達，隨后稍有減弱，這三個基因在MeJA處理后表達