犬骨髓間充質干細胞移植治療心肌梗死的實驗研究.pdf

1、研究背景:心肌梗死是嚴重危害中老年人身體健康的常見病、多發(fā)病。由于成人心肌組織無分化再生能力，其壞死心肌細胞只能由成纖維細胞取代而形成無收縮功能的瘢痕組織，終致心衰，甚至猝死，嚴重影響患者生活質量和壽命。目前各種治療心肌梗死的方法如藥物、介入、手術治療僅適于80％的患者，且只能改善心肌缺血，不能挽救壞死心肌，對于上述方法無效的20％患者尚無有效的方法。心臟移植雖能取代病損心臟，但供體難選、技術復雜、費用高而限制了其廣泛應用?；蛑委煹挠?/p>

2、效發(fā)揮亦依賴于一定數量有功能的心肌細胞。 目的:(1)探討分離、培養(yǎng)、純化和鑒定犬MSCs方法，觀察MSCs體外培養(yǎng)增殖的生長特征；(2)制備犬心肌梗死模型，¨天后運用超聲心動圖及99mTc．MIBI靜息心肌灌注顯像(SPECT)對其心功能改變情況進行評價；(3)探討自體MSCs移植對犬心肌梗死的治療意義，旨在為干細胞治療心肌梗死的臨床應用奠定基礎。 方法:第一部分：探討了犬MSCs的體外分離、純化、擴增和鑒定。首先采用

3、密度為1．073g／mL的Percoll分離液分離犬骨髓中的單個核細胞，進而獲得MSCs，用IMEM+10％胎牛血清作為基本培養(yǎng)基，通過及時、反復傳代對MSCs進行純化和擴增培養(yǎng)，平均每7天在細胞達70-80％融合時，傳代一次。10mi骨髓體外擴增2代后可獲得(1．2．1．35)×107個細胞。測定生長曲線，形念學觀察。流式細胞儀檢測擴增后MSCs細胞周期及表面抗原特性。第二部分：通過結扎犬冠狀動脈左前降支近端建立心肌梗死模型，并進行臨

4、床評價。選取雜種犬14只，體重12～18Kg。建立模型前進行心電圖、超聲及SPECT檢查，了解基礎心電圖和心功能。常規(guī)麻醉實驗犬，通過胸骨左緣第4肋間開胸，暴露心臟，結扎左冠狀動脈前降支，建立AMI模型，同時行心電圖檢查?！旌笮谐曅膭訄D及SPECT檢查予以證實模型成功。第三部分：在第一、二部分研究的基礎上，觀察移植自體MSCs對犬心肌梗死的治療效果(心肌梗死面積、新生血管數量、心功能等)。心梗模型犬建立2周后隨機分為如下2組：組I(

5、MSCs組)，注射MSCs2ml，n=lO；組II(AMI對照組)，注射無血清IMDM培養(yǎng)基2mi，n=4。二次開胸于梗死部位注射干細胞或培養(yǎng)基，細胞移植前均經4’，6’．二乙酰基．2．苯基吲哚(4',6'-diamidino-2．phenylindole，DAPI)標記。所有動物于細胞移植后4周采用超聲心動圖評價心功能。實驗結束時處死動物，取出組織，主要觀察組織重構和細胞存活等情況。結果(1)MSCs屬骨髓中單個核細胞，密度梯度離心結

6、合貼壁培養(yǎng)法能有效分離純化犬骨髓MSCs，MSCs在含lO％小牛血清的IMEM中生長性狀相對穩(wěn)定，1、3、5代細胞生長曲線基本一致，增殖速度快。細胞呈均一的成纖維細胞樣，流式細胞儀檢測表明MSCs強表達干細胞標記CD44，而不表達造血干細胞特異抗原CD34、CDlla、CDl4和HLA-DR，屬非造血干細胞的另一群干細胞。細胞周期顯示有82．4％的細胞處于G0／G1期。(2)犬冠狀動脈前降支結扎后，心電監(jiān)護示心率加快和室性早搏，ST段壓

7、低：模型制備后¨天超聲心動圖顯示有室壁活動減弱，部分有室壁瘤存在，心梗區(qū)心肌變薄。射血分數(EF)、每搏量(SV)、左室短軸縮短率(FS)下降，較結扎前差異顯著(P<0．05)，99mTc-MIBl示：心尖部、左室前壁、室間隔明顯充盈缺損，表明犬心梗模型制備成功。(3)細胞移植后4周，實驗組和對照組共14例全部存活，超聲心動圖顯示實驗組左室EF、SV、FS、LVD、LSD較移植前明顯改善(P<0．05)；而對照組(細胞培養(yǎng)液移植)4周后

8、左室EF、SV、FS、LVD、LSD較移植前差異不顯著(P>0．05)。實驗組心功能改善程度較對照組差異顯著(P<0．05)。99mTc-MIBI檢查顯示：細胞移植組原心尖部、前壁缺損區(qū)再填充明顯，而對照組原心尖部、前壁缺損區(qū)再填充不明顯。 結論:(1)密度梯度離心結合貼壁培養(yǎng)法能有效分離、純化和擴增犬骨髓MSCs，建立了體外分離、純化、培養(yǎng)擴增犬骨髓MSCs的方法，為進一步深入研究骨髓間充質干細胞的應用打下基礎。(2)犬心梗模