磁標記間充質干細胞治療急性心肌梗死的實驗研究.pdf

1、大量動物和臨床試驗表明骨髓干細胞移植能有效改善缺血心臟功能,但評價細胞植入、分布、存活、遷移的細胞標記示蹤研究明顯滯后。利用磁共振(MR)活體示蹤技術評價心肌梗死干細胞治療的研究目前尚處于起始階段,尚存在許多亟待解決的問題。
　　 本研究立足于心臟病細胞治療中的示蹤熱點,在優(yōu)化了豬急性心肌梗死模型的基礎上,采用超順磁性氧化鐵納米顆粒Resovist標記豬骨髓間充質干細胞(MSCs);對磁標MSCs的體外、心肌內移植MR影像學特點

2、、活體長期MR示蹤可行性進行了詳細研究。
　　 體外研究結果發(fā)現,Resovist可高效安全標記細胞,MR信號能一定程度上反映磁標記細胞的數量,Resovist顆粒在細胞內停留時間約為2周。動物實驗發(fā)現,磁共振成像對活體心肌內移植的磁標細胞具定位、相對定量價值,但磁共振無法區(qū)分細胞內外鐵顆粒;磁共振長期活體細胞示蹤并不能反映細胞轉歸,可能與心肌組織無法及時清除磁標細胞釋放的間質鐵顆粒有關。量效關系研究發(fā)現,間充質干細胞局部移植治

3、療豬心肌梗死的療效呈劑量依賴性。
　　 第一部分冠脈結扎法制作豬急性心肌梗死模型的優(yōu)化
　　 目的:(1)比較前降支結扎坐標(對角支vs.LAD百分位點)對豬心肌梗死模型穩(wěn)定性的影響,以期指導研究者根據模型的心功能要求選擇合適的LAD結扎位置;(2)探討前降支結扎后發(fā)生室顫的特點及其相關因素,提高動物成活率。
　　 方法:(1)47頭小型豬隨機分為兩組:A組(n=24)結扎LAD第二對角支開口遠端;B組(n=23

4、)結扎LAD中遠1/3交界處。分別于術前、術后1小時心臟超聲檢查左室射血分數(LVEF),術后3天進行常規(guī)冠脈造影,4周處死測量LAD結扎位點和梗死體積,并比較兩組間各指標變異程度,用簡單直線回歸模型分析LAD結扎百分位點和心梗體積、LVEF相關性和回歸方程。(2)57只小型豬開胸結扎心臟LAD不同位點,對室顫和體重、性別、術前心率、術前LVEF、開胸徑路(旁正中/肋間)、手術時間、結扎百分位點、術后心率、術后發(fā)生室早或短陣室速等因素進

5、行單因素相關分析和Logistic回歸分析。
　　 結果:(1)B組結扎位點距離LAD開口長度、梗死體積、術后LVEF的變異較小;冠脈造影示對角支的開口、直徑和數量存在很大變異;LAD結扎百分位點和梗死心肌體積、術后LVEF均明顯相關;線性回歸方程分別為:心肌梗死體積(％)=-0.54×結扎百分位點+48.06;術后LVEF(％)=0.56×結扎百分位點+10.49。(2)室顫均發(fā)生在結扎冠脈后35min內,高峰時間為結扎冠脈后

6、5min和20min;心率快于160bpm或慢于60bpm時容易誘發(fā)室顫。與非室顫組動物比較,室顫組動物的結扎位點高,術后最快心率＞60bpm的動物較多,短陣室速發(fā)生率高。Logistic回歸分析顯示結扎位點過高是急性心肌梗死后發(fā)生室顫唯一的獨立危險因素。
　　 結論:(1)由于對角支變異較大,以LAD全長為坐標選擇合適的結扎百分位點可能是一種較為理想的豬心肌梗死模型建立方法。(2)結扎位點過高是豬急性心肌梗死后發(fā)生室顫的最重要

7、危險因素;冠脈結扎后30min內應該嚴密心電監(jiān)護,特別注意結扎冠脈后5min和20min二個時間點、＞160bpm或＜60bpm二種心率、以及短陣室速等先兆事件。
　　 第二部分豬間充質干細胞的磁化標記和體外MR成像
　　 目的:確定超順磁性氧化鐵納米顆粒Resovist標記豬骨髓間充質干細胞的合適方案,探討磁標干細胞的體外MR成像特點、影響因素和鐵衰減特點。
　　 方法:分離培養(yǎng)鑒定豬骨髓間充質干細胞后,首先用

8、不同Resovist濃度、不同共孵育時間標記,根據標記效率指標(普魯士藍染色、細胞鐵濃度測定、細胞透射電鏡檢查)和標記毒性指標(臺盼藍排除試驗、CCK-8試驗)確定適宜標記條件。然后收集不同數量標記細胞重懸于瓊脂糖EP管或將細胞沉淀注入凝膠,進行1.5TMR儀不同序列體外成像,分析體外鐵標細胞的MR成像特點和檢測閾值。最后收集標記后不同時間點細胞進行普魯士藍染色、細胞內鐵離子濃度測定和MR成像,分析細胞內鐵顆粒衰減特點。
　　

9、結果:(1)權衡標記效率和標記毒性,“25:0.75μg/mlResovist-PLL24h標記方案”和“50:1.5μg/mlResovist-PLL24h標記方案”是比較合適的標記策略。此二種方案標記后,細胞內鐵平均含量為(13.13±2.30)pg和(23.77±2.06)pg,普魯士藍染標記率接近100％,電鏡檢查顯示胞質內含鐵致密顆粒囊泡,細胞微細結構未見破壞和毒性作用。(2)相比FSET2WI和FSET1WI,T2*WIfl

10、ash信號改變最為明顯;成像細胞數量越多,信號改變越明顯。臨床用1.5TMR成像儀體外MRT2*WIflash檢測閾值為5×104～1×105個細胞。(3)隨著標記后體外培養(yǎng)時間延長,細胞內鐵逐漸減少,16d時鐵含量接近標記前水平,12dMR信號強度和標記前無差異.
　　 結論:“25:0.75μg/mlResovist-PLL24h標記方案”和“50:1.5μg/mlResovist-PLL24h標記方案”可高效標記豬MSCs

11、;體外MR信號強度能一定程度上反映磁標記細胞的數量;Resovist顆粒可在體外MSCs細胞內停留2周左右時間。
　　 第三部分磁標記豬間充質干細胞心肌內移植的體內MR成像
　　 目的:探討活體心肌內磁標干細胞MR成像的特點和影響因素,研究MR成像對標記細胞的定性、定量和定位價值。
　　 方法:“50:1.5μg/mlResovist-PLL24h標記方案”磁化標記豬骨髓MSCs,并用DAPI和PKH26進行熒光

12、標記。然后將MSCs經心外膜直接注入豬急性梗死心肌內,每頭豬注射3點。根據每注射點細胞數量以及細胞是否鐵標記,15頭豬隨機分成5組(每組n=3):2×106標記細胞組、1×106標記細胞組、5×105標記細胞組、1×106未標記細胞組和單純SPIO組。細胞移植后20～24h行豬心臟1.5TMR成像,包括快速自旋回波(FSE)T1WI和T2WI序列、快速小角度反轉梯度回波T2WI-flash、T2-MAP以及注射造影劑后的T2WI-fla

13、sh。1h后處死并根據MRI圖像切取心肌組織行普魯士藍染色和免疫熒光檢查。
　　 結果:(1)體外標記:鐵標記率為100％,DAPI和PK‰共陽性率達(93±5)％。(2)MRI:未標記細胞組未顯示低信號區(qū);單純SPIO組和標記細胞各組均可顯示低信號區(qū)。相比TrueFrsp序列、T1WI-FSE和T2WI-FSE序列,T2WI-flash序列能更清晰的顯示移植的磁標記細胞;T2-MAP序列成像和釓噴酸葡胺注射后T2WI-flas

14、h序列成像,圖像質量優(yōu)于單純T2WI-flash序列成像.可有效避免心電門控欠佳和呼吸心跳頻率影響。T2WI-flash結合TrueFrsp序列(或T1WI-FSE或T2WI-FSE序列),或者釓噴酸葡胺注射后T2WI-flash序列,或者采用T2-MAP成像序列,MR可判斷操作成功率。心臟T2WI-flash成像時,心肌內低信號區(qū)面積和回波時間呈線性相關。臨床用1.5TMRI儀至少可以探測到活體心臟內5×105的細胞數量。在回波時間相

15、近或相同的情況下,注射點低信號區(qū)的面積大小與移植細胞數量顯著正相關。(3)組織學檢查:各標記細胞組動物MRI低信號區(qū)心肌病理學檢查見普魯士藍染色、DAPI和PKH26三重陽性細胞存在;無SPIO標記細胞組注射部位心肌中存在DAPI和PKH26陽性細胞,單純SPIO組心肌注射點顯示細胞外游離的鐵顆粒。
　　 結論:應用磁共振對超順磁性氧化鐵標記的干細胞進行活體心肌內成像是可行的,具定位、相對定量價值,但無法區(qū)分細胞內、外鐵顆粒。<

16、br>　　 第四部分磁標記間充質干細胞治療急性心肌梗死的磁共振長期示蹤和量效關系研究
　　 目的:量效關系是細胞移植治療心肌梗死療效評價中必不可少的組成部分,但文獻較少。細胞磁共振成像能否長期示蹤并真實反映移植細胞的遷移尚不清楚。本研究用MRI監(jiān)測不同劑量的磁標MSCs移植治療豬急性心肌梗死,觀察移植細胞劑量和移植療效的關系,并探討MRI在示蹤干細胞中的價值。
　　 方法:開胸結扎冠狀動脈LAD建立豬急性心肌梗死模型,

17、將磁標MSCs經心外膜直接注入梗死交界區(qū)心肌內,每頭豬注射10點。根據移植細胞數量,15頭豬隨機分成3組:高劑量組(移植細胞量2×107,n=5)、中等劑量組(移植細胞量1×107,n=5)、低劑量組(移植細胞量5×106,n=5)。對照組僅注射DMEM(n=5)。細胞移植后24和1、3、6個月行豬心臟1.5TMR成像,采集心臟功能、測定梗死面積、移植細胞信號改變等信息。6個月處死,梗死區(qū)和梗死交界區(qū)切片進行HE染色、Mallory染色

18、觀察組織細胞形態(tài)和纖維化情況:Ⅷ因子免疫熒光評價新生血管情況;Tunel法免疫組化觀察組織細胞凋亡情況;普魯士藍染色和CD68免疫組化觀察鐵顆粒狀態(tài)和心肌細胞、巨噬細胞的關系;
　　 結果:(1)磁共振心功能檢查發(fā)現,對照組和低、中、高劑量組基線LVEF平均值分別為29.96％±1.45％、30.04％±2.20％、29.80％±2.82％和29.04％±1.60％。與對照組比較,移植3個月后低、中和高劑量組分別增加0.12％、

19、1.78％、3.72％和6.68％,隨訪6個月后分別增加-1.08％、1.82％、4.10％和7.24％。重復測量分析顯示心功能改善隨細胞劑量不同而不同,細胞劑量和心功能改善幅度相關。(2)細胞磁共振活體示蹤發(fā)現基本演變趨勢為:移植后3d呈邊界清晰的低信號;隨后邊界模糊,面積擴大,與正常交界的心內膜緣呈低信號;注射點對比度下降,并逐漸隱退或消失。組間比較發(fā)現劑量越高,顯示率越高,信號示蹤時間越長,細胞移行現象越明顯。(3)磁共振測量梗死

20、面積發(fā)現,對照組和低、中、高劑量組的基線R心梗均值分別為18.50％±1.94％、19.78％±1.43％、18.96％±1-33％和19.48％±1.12％;與對照組比較,移植3個月低、中和高劑量組分別減少0.86％、3.16％、3.52％和5.24％,隨訪6個月后分別減少1.12％、3.72％、4.62％和6％。重復測量分析顯示,細胞劑量和梗死面積變化相關。(4)新生血管密度與移植細胞數量密切相關,梗死周邊區(qū)低、中和高劑量組新生血管

21、密度分別是對照組的1.35倍、2.89倍和4.71倍;梗死區(qū)低、中和高劑量組分別是對照組的1.23倍、2.36倍、4.18倍。(5)梗死以及梗死邊緣區(qū)凋亡指數(AI),對照組為4.2±1.0,低、中、高劑量組均顯著低于對照組,分別為2.4±1.7、1.3±1.2、0.8±1.1(P均＜0.05);有“劑量越大、凋亡越少”的趨勢,提示移植細胞不僅減少凋亡,與移植細胞數量可能相關。(6)普魯士藍染色和CD68免疫組化:絕大部分鐵顆粒游離于細