SnoN蛋白在高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化中的作用及其表達的分子調(diào)控機制.pdf

1、腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化（EMT）是糖尿病腎?。―N)腎小管間質(zhì)纖維化的主要細胞分子機制之一，在DN腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。但由于這一過程涉及多種細胞事件和分子介質(zhì)的參與和相互作用，影響因素眾多且作用復(fù)雜，故對其分子機制的認識仍十分有限。本實驗?zāi)康氖遣捎锰悄虿。―M）大鼠模型和體外經(jīng)高糖處理的大鼠原代腎小管上皮細胞，研究在高糖條件下腎小管上皮細胞中核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN(Ski-related novel prote

2、in N)的表達變化、與DN發(fā)病過程中腎小管EMT的關(guān)系及其表達的分子調(diào)控機制，探討SnoN在DN腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)病機制中的作用。
　　本實驗采用病理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法進行研究。用鏈脲佐菌素（STZ）尾靜脈注射復(fù)制大鼠DM模型，分別于成模2周（w）、4w、8w、12w、16w和24w時處死，每組均設(shè)鼠齡匹配的正常對照組；部分DM大鼠從成模13w起，用精蛋白鋅胰島素治療，以血糖控制在4~7mmol/L，尿糖陰性為準，分別

3、于成模16w和24w時處死，同時設(shè)鼠齡匹配的正常對照組和DM組；應(yīng)用生化方法測血糖、血肌酐和24小時（h）尿蛋白，計算腎臟指數(shù)；HE（hematoxylin and eosin）和PAS（p-aminosalicylic acid）染色光鏡觀察腎臟和胰腺形態(tài)學(xué)改變，間接免疫熒光檢測胰腺組織胰島素表達。并采用原代培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞，從細胞形態(tài)、生長周期、上皮細胞標志性蛋白細胞角蛋白-18（CK-18）、E-鈣黏素（E-cadherin

4、）和間質(zhì)細胞標志性蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等方面鑒定所培養(yǎng)細胞；原代培養(yǎng)的腎小管上皮細胞分三組：①對照組：DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2％FBS培養(yǎng)，②高滲組：19.5mmol/L D-mannitol+ DMEM+2% FBS培養(yǎng)，③高糖組：19.5mmol/L D-glucose+DMEM+2%FBS培養(yǎng)，每組設(shè)30分鐘（min）,2h,12h,24h,48h,72h和96h七個時間點進行觀察； Western

5、 blot、免疫組織化學(xué)、免疫細胞化學(xué)和RT-PCR技術(shù)，動態(tài)觀察SnoN、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/Smads、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2（ERK1/2）信號通路及E3泛素連接Smurf2(Smad ubiquitination regulatory factor2)和APC（anaphase promoting complex）在各組大鼠腎組織和高糖

6、培養(yǎng)大鼠原代腎小管上皮細胞中的表達；并應(yīng)用siRNA技術(shù)敲低SnoN表達，進一步明確SnoN在DN腎小管EMT發(fā)生中的作用。
　　本實驗研究結(jié)果顯示，在整個實驗期間，注射STZ大鼠血糖持續(xù)在高水平，從2w開始即出現(xiàn)血肌酐，24h尿蛋白及腎臟指數(shù)的明顯增加；病理觀察發(fā)現(xiàn)，注射STZ大鼠胰島結(jié)構(gòu)嚴重破壞，胰島素分泌顯著減少，腎組織出現(xiàn)炎細胞浸潤和纖維化表現(xiàn)；這些結(jié)果表明本實驗成功復(fù)制了大鼠DM模型。培養(yǎng)細胞呈典型鋪路石樣生長，CK-1

7、8和E-cadherin蛋白呈陽性表達，且?guī)缀蹩床坏溅?SMA蛋白陽性表達，表明原代培養(yǎng)細胞是腎小管上皮細胞。
　　研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SnoN、TGF-β1、Smad2/3、HGF、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、Smurf2和APC在大鼠腎小管上皮細胞中均有表達；與正常對照組相比，DM大鼠腎組織和高糖處理腎小管上皮細胞中SnoN蛋白表達減少；隨DM病程進展和高糖培養(yǎng)時間延長，DM大鼠腎組織和腎小管上皮細胞中FN蛋白和m

8、RNA表達增多?？刂蒲悄苌险{(diào)DM大鼠腎小管上皮細胞SnoN蛋白和mRNA表達，下調(diào)FN蛋白表達，并伴有尿蛋白和血肌酐的降低及腎纖維化的改善；高糖轉(zhuǎn)入正常糖培養(yǎng)能顯著上調(diào)腎小管上皮細胞SnoN蛋白和mRNA表達，下調(diào)FN蛋白表達。研究還發(fā)現(xiàn)，高糖抑制體內(nèi)外腎小管上皮細胞SnoN蛋白表達的同時，能增加腎小管上皮細胞中TGF-β1、Smad2/3、phospho-Smad2和phospho-Smad3蛋白的表達，增強TGF-β1/Smads

9、信號的活化，誘導(dǎo)體內(nèi)體外腎小管EMT的發(fā)生；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，高糖條件下，SnoN與CK-18和E-cadherin呈顯著正相關(guān)，與α-SMA表達呈顯著負相關(guān)；且siRNA抑制SnoN表達，可使高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞CK-18和E-cadherin蛋白表達減少、α-SMA蛋白表達增加。DM大鼠腎組織和高糖培養(yǎng)腎小管上皮細胞中SnoN mRNA表達與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，高糖能增加體內(nèi)外腎小管上皮細胞中HGF、ERK1/2、phos

10、pho-ERK1/2的表達；研究還發(fā)現(xiàn)，與同時間點正常大鼠腎組織及高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中的表達量相比，高糖能增加體內(nèi)外腎小管上皮細胞中E3泛素連接酶Smurf2和APC10蛋白表達。
　　研究結(jié)果表明，（1）高糖抑制體內(nèi)外腎小管上皮細胞中SnoN蛋白表達；（2）SnoN蛋白參與了DN發(fā)病過程中腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化；（3）高糖環(huán)境中腎小管上皮細胞SnoN蛋白表達減少不是由其基因轉(zhuǎn)錄的改變引起的；可能與E3泛素連接酶S

11、murf2和APC介導(dǎo)的SnoN蛋白泛素化降解有關(guān)。
　　綜上所述，在DN腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展機制中，高糖抑制了腎小管上皮細胞中SnoN蛋白表達，而SnoN蛋白表達減少參與了高糖誘導(dǎo)的腎小管EMT過程，是DN腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生的主要機制之一，該發(fā)現(xiàn)對闡明DN發(fā)病機制有重要意義。研究還發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境中腎小管上皮細胞SnoN蛋白表達減少不是由其基因轉(zhuǎn)錄的改變引起的，可能與E3泛素連接酶Smurf2和APC介導(dǎo)的SnoN蛋白