睪丸新基因的克隆及其在隱睪模型中的表達分析.pdf

1、第一部分 目的：克隆睪丸發(fā)育及生精相關基因，為進一步研究其功能、精子發(fā)生的分子調(diào)控機制奠定基礎。 方法：從二級表達序列標簽（expressed sequence tags，EST）數(shù)據(jù)庫ZooDDD中獲得人類正常睪丸表達的EST，檢索其同源序列，應用Biolign軟件拼接成基序（contigs），GeneScan軟件預測對應基因組序列中的外顯子位置，并將其拼接成完整的編碼序列；針對開放閱讀框設計引物序列，采用RT-PCR

2、 從人類睪丸組織中克隆新基因的cDNA，分析該基因在人類各臟器組織中的表達，并對測序結(jié)果進行生物信息學分析。 結(jié)果：在人類22 號染色體的49311047 K—49368620K 間克隆出一新基因THEG-2，編碼序列全長267 bp，編碼88個氨基酸，分子量MW10601.09，等電點4.32。RT-PCR 證實該基因開放閱讀框正確，在人類睪丸組織中高表達，獲得GenBank登錄號EU079024。預測THEG-2蛋白理論等電

3、點為pI 4.32，相對分子量為MW10601.09，其亞細胞定位可能位于細胞核，功能預測為生長因子。 結(jié)論：獲得人類睪丸高表達基因THEG-2，為進一步研究該基因的生物學功能和表達調(diào)控奠定了基礎。 第二部分 目的：利用模式生物小鼠，探討睪丸高表達基因THEG-2 在睪丸發(fā)育過程中的作用。 方法：通過dbEST數(shù)據(jù)庫檢索出與THEG-2基因高度同源的EST序列，構(gòu)建EST疊加群（contigs），Biol

4、ign軟件拼接，GeneScan軟件預測contigs 對應的基因組序列中的外顯子、內(nèi)含子；針對開放閱讀框設計引物序列，采用RT-PCR 從小鼠睪丸組織中克隆新基因的cDNA，分析該基因在小鼠睪丸不同發(fā)育階段中的表達，并對測序結(jié)果進行生物信息學分析。 結(jié)果：成功克隆了THEG-2 高度同源的小鼠睪丸新基因TSEG-2，全長451 bp，開放閱讀框為267 bp，編碼88個氨基酸。RT-PCR 證實該基因開放閱讀框正確，TSEG-

5、2 在小鼠睪丸組織中特異性表達，在4、9、14、18、21、38日齡和2、6月齡小鼠睪丸組織中呈現(xiàn)規(guī)律性表達,且與小鼠其它cDNA 無同源性，獲得GenBank 登錄號EU079025。功能區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，小鼠TSEG-2 cDNA序列定位于染色體15qE3，為可溶性非分泌型蛋白，有2個可能的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點，1個酪蛋白激酶(CK2) Ⅱ磷酸化位點，并可能是一種核蛋白。結(jié)論：獲得小鼠睪丸特異性表達基因TSEG-2，與睪丸發(fā)育各

6、階段密切相關。 第三部分 目的：建立雌二醇誘導的小鼠隱睪模型，并對其進行組織形態(tài)學觀察，同時對新克隆的TSEG-2基因在隱睪模型的表達特征進行研究。 方法：35 只雄性新生BABL/C 仔鼠隨機分為正常對照組、溶劑對照組和實驗組。實驗組（n=15）于生后第3-30天皮下注射17-β雌二醇4 μl(4 μg/d)，溶劑對照組（n=10）皮下注射等量丙二醇，正常對照組不給予任何處理。生后第35天，觀察各組睪丸位置、大

7、小，采用HE 染色、透射電鏡進行組織形態(tài)學觀測。采用RT-PCR 方法研究TSEG-2基因在隱睪模型中的表達特點。 結(jié)果：實驗組隱睪發(fā)生率100％，均為雙側(cè)隱睪，而對照組和溶劑對照組無隱睪發(fā)生。與對照組比較，實驗組睪丸大小明顯縮小，生精小管上皮數(shù)目減少，管腔消失，精母細胞和精原細胞核皺縮，支持細胞和間質(zhì)細胞核仁空泡變性，未見成熟精子。 對照組和溶劑對照組TSEG-2基因高表達，而TSEG-2基因在隱睪模型組中表達顯著下調(diào)