染料木黃酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組和黏附能力的作用及機(jī)制研究.pdf

1、染料木黃酮(genistein)是一種從大豆中提取的天然異黃酮類(lèi)物質(zhì)，它作為蛋白酪氨酸激酶的抑制劑，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，但其確切的作用機(jī)制尚不清楚。眾所周知，腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附是其發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素，腫瘤細(xì)胞黏附能力的改變勢(shì)必會(huì)影響其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。具有維持細(xì)胞形態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等功能的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞內(nèi)存在數(shù)十種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(actin bind

2、ing protein)通過(guò)與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合與解離，調(diào)節(jié)其聚合/解聚過(guò)程，改變F．肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的含量和分布，影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)眾多細(xì)胞功能的調(diào)控。熱休克蛋白27(heat shock protein 27，Hsp27)作為一種重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)可被p3 8激酶信號(hào)途徑磷酸化，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合/解聚過(guò)程，使肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重組。已有研究表明，在體外染料木黃酮具有抑制p38激酶活性的作

3、用，因此，我們推測(cè)，染料木黃酮可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)p38激酶的活性，降低Hsp27磷酸化水平，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，影響腫瘤細(xì)胞的黏附能力。 為證實(shí)以上推測(cè)，本研究選用具有高轉(zhuǎn)移潛能的人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-435細(xì)胞)，設(shè)計(jì)并進(jìn)行了以下兩部分實(shí)驗(yàn)：(1)觀察染料木黃酮對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞黏附能力的影響，進(jìn)而闡明兩者之間的關(guān)系；(2)通過(guò)研究p38激酶和Hsp27是否介導(dǎo)染料木黃酮誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨

4、架的重組，從而初步探討染料木黃酮所致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組的作用機(jī)制。 第一部分不同濃度染料木黃酮(12.5、25、50和100μmol/L)體外孵育MDA-MB-435細(xì)胞24h后，分別用熒光染色法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡法觀察肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組情況；噻唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)人工重組基底膜(Matrigel)黏附能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮使MDA-MB-435細(xì)胞內(nèi)F-肌動(dòng)蛋白排列和分布明顯改變，并且其含量明顯降

5、低；同時(shí)細(xì)胞與Matrigel的黏附率與對(duì)照組相比明顯降低，其效應(yīng)具有劑量依賴(lài)性。本研究結(jié)果表明，染料木黃酮可促進(jìn)MDA-MB-435細(xì)胞內(nèi)F-肌動(dòng)蛋白解聚，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組是其體外降低細(xì)胞黏附能力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 第二部分不同濃度染料木黃酮(12.5、25、50和100μmol/L)體外孵育MDA-MB-435細(xì)胞24h后，分別用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞的凋亡情況；用免疫印跡法研究細(xì)胞內(nèi)ERK1/2和p38激酶的表達(dá)及活性的改變

6、，同時(shí)分析Hsp27的表達(dá)、磷酸化水平及其在細(xì)胞內(nèi)定位的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮處理24h未能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，細(xì)胞內(nèi)ERK1/2活性在對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)顯著性差異。p38激酶和Hsp27的蛋白總量無(wú)明顯改變，但二者磷酸化水平隨著染料木黃酮處理濃度的增加逐漸降低；與此相應(yīng)的是Hsp27在胞漿中含量明顯減少，在細(xì)胞骨架中含量明顯增多。本研究結(jié)果表明，染料木黃酮引起F-肌動(dòng)蛋白解聚，進(jìn)而降低細(xì)胞的黏附能力并非由于其改變了細(xì)胞內(nèi)ER

7、K1/2的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡所致；p38激酶途徑以及Hsp27磷酸化/脫磷酸化過(guò)程參與介導(dǎo)染料木黃酮所致MDA-MB-435細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組。通過(guò)以上研究，我們得出以下結(jié)論： 1.染料木黃酮所致-MDA-MB-435細(xì)胞內(nèi)F-肌動(dòng)蛋白解聚，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組是其體外降低細(xì)胞黏附能力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。 2．p38激酶途徑以及Hsp27磷酸化/脫磷酸化過(guò)程參與介導(dǎo)染料木黃酮所致MDA-MB-435肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨