靶向siRNA阻斷NF-κB信號通路對膽管癌增殖和侵襲影響的實驗研究.pdf

1、膽管癌起源于膽管上皮細胞惡性腫瘤，是肝膽外科常見的惡性腫瘤之一。由于其早期診斷困難及其自身臨床病理特征，癌細胞容易沿血管及神經(jīng)鞘浸潤擴散。雖然手術是唯一可能獲得治愈的手段，但大部分根治手術切除率低術后易復發(fā)，且放化療無助于生存率的提高，目前缺乏對膽管癌有效治療手段。基于癌的發(fā)生是一個多因素、多階段、復雜漸進過程，干預或終止其中某個或多個相關因素或過程，能夠改變癌發(fā)生發(fā)展的進程，達到化學預防和治療的目的。針對腫瘤相關因子，明確基因功能，選

2、擇靶點進行化學干預，是惡性腫瘤的預防和治療策略。實施這些策略的首要前提是必須確定和選擇作用靶點，即研究腫瘤相關基因的功能和表達。流行病學調查膽管癌發(fā)病的高危因素共同病理特征是膽道的慢性炎癥。 NF-κB作為一種普遍存在的轉錄因子，不僅參與介導免疫應答、炎癥反應、細胞凋亡和增殖的多種基因的表達調控，而且NF-κB的異常激活還在多種腫瘤細胞的增殖侵襲調控中發(fā)揮中樞性作用，是“炎癌鏈”的關鍵調控環(huán)節(jié)。有證據(jù)表明針對抑制炎癥介質釋放的

3、非甾體類抗炎藥物(NSAIDs)能顯著減少許多炎癥相關性腫瘤發(fā)生的風險，日益凸顯作為化學預防和輔助治療藥物的效用。在部分實體腫瘤的臨床及基礎研究揭示針對NF-κB信號通路中下游基因COX-2表達可作為腫瘤預后重要指標，環(huán)氧化合酶-2選擇性抑制劑非甾體類抗炎藥物能減少腸癌發(fā)生率。NF-κB信號通路是近年來研究腫瘤潛在性靶點重大發(fā)現(xiàn)之一，NF-κB在多數(shù)腫瘤細胞存在過表達，可能上調啟動子中含有NF-κB結合位點的COX-2、iNOS下游基因

4、，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移有關。非淄類抗炎藥物在拮抗炎癥及抗腫瘤反應方面，雖療效確切，但因其作用廣泛，故對機體有一定的毒、副作用，且由于眾多的炎癥介質(包括尚未發(fā)現(xiàn)的炎癥介質)構成的復雜網(wǎng)絡及炎癥介質介導使得針對單一(或少量)炎癥介質的逐一對抗腫瘤措施顯得力不從心，而多種抗體/拮抗劑/抑制劑的聯(lián)合搭配使用雖有可能提高療效，但在臨床實施過程中顯然不太可行。只有從調控“炎癌鏈反應”的“瓶頸”-即關鍵環(huán)節(jié)進行干預，才有可能從根本上解決逆轉炎癥

5、狀態(tài)從而調控腫瘤細胞增生的微環(huán)境達到根本上預防治療腫瘤，NF-κB被認為極具潛力的新型抗腫瘤靶點，從理論上講，如能有效拮抗NF-κB活化，則可起到以一當十、事半功倍的抗腫瘤效果。本課題正是基于膽管癌主要慢性炎癥的病理特點，著眼NF-κB信號通路“炎癌鏈”關鍵調控環(huán)節(jié)的基礎上，進一步通過體內(nèi)和體外實驗觀察膽管癌NF-κB信號表達情況，并利用NF-κBp65靶向性小干擾技術阻斷NF-κB信號通路，探討體內(nèi)外抗增殖及侵潤作用，以期為獲取具有自

6、主知識產(chǎn)權的抗腫瘤藥物先導物的形成提供契機，并為具有兼顧拮抗失控性炎癥反應和抗腫瘤的新型靶向性抗腫瘤藥物的臨床過渡奠定基礎。 目的： 探討NF-κB的表達在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，及其與COX-2和iNOS的關系，并設計應用小干擾RNA(siRNA)沉默膽管癌細胞的NF-κB，研究其阻斷NF-κB信號通路后體內(nèi)外抑制細胞增殖侵襲影響效果及作用機制。應用免疫組織化學染色法、WesternBlotting分別檢測中膽管癌組織

7、NF-κB、COX-2及iNOS基因蛋白分布表達情況。分析NF-κB表達與COX-2及iNOS表達的相關性以及在膽管癌中表達的臨床應用價值：進一步應用RNA干擾技術手段，以NF-κBp65為靶點，篩選優(yōu)化siRNA，探討靶向NF-κBp65-siRNA對膽管癌細胞中NF-κBp65基因蛋白表達及細胞增殖影響，從而為NF-κB信號通路NF-κB作為抗瘤潛在靶點的功能研究開辟了一個新的途徑，并對靶向NF-κB抑制膽管癌細胞的體內(nèi)效果做了進一

8、步的驗證，為探求靶向的基因治療在膽管癌基因治療中的可行性、效應及初步的作用機制。為臨床炎癥相關性腫瘤的治療探索新方法。 方法： 收集臨床病理資料完整的膽管癌組織石蠟標本69份及其癌旁組織石蠟標本19份，新鮮肝外膽管癌組織及癌旁組織9份，另有同期良性膽道石蠟標本56份做為對照組，其中包括：慢性膽囊炎27例，硬化性膽管炎，膽管囊性擴張13例。分別應用免疫組化法、免疫印跡技術檢測以上標本中NF-κB與iNOS、COX-2的表達

9、，分析NF-κB的表達與COX-2及iNOS表達的相關性及它們與膽管癌發(fā)生的臨床相關性。在體外實驗中，利用QBC939膽管癌細胞系，干擾過表達NF-κB p65，以MTT法、流式細胞儀、激光共聚焦分析NF-κBp65對膽管癌細胞體外增殖活性、侵襲性的影響，并觀察其定位；進一步應用western blotting、RT-PCR研究靶向NF-κBp65的siRNA對下游基因的影響作用及細胞凋亡的分子機制。最后，通過建立膽管癌裸鼠移植瘤模型，

10、應用靶向NF-κBp65的siRNA進行瘤體內(nèi)多點注射，觀察靶向NF-κBp65的siRNA對人膽管癌裸鼠移植瘤抗腫瘤效果。 結果： 69膽管癌組織病理切片免疫組化檢測結果顯示：膽管癌組織中NF-κB與iNOS、COX-2的陽性表達率分別是74.07％、66.67％和62.9％，NF-κB與iNOS、COX-2在膽管癌組織中的表達水平明顯高正常組織中的表達水平(P＜0.05)，NF-κB與iNOS、COX-2的表達與膽管

11、癌的浸潤程度、淋巴結轉移及分化程度有關(P＜0.05)；免疫印跡技術NF-κB與iNOS、COX-2蛋白表達水平在癌組織中明顯高于對應的癌旁組織(P＜0.05)。NF-κB與iNOS、COX-2的表達呈正相關，聯(lián)合檢測提示可作為膽管癌總體生存的負預后因素。Western blotting和RT-PCR檢測結果顯示體外設計合成的NF-κB p65靶向siRNA優(yōu)化后的濃度1.2μg/ml轉染QBC939細胞后48h NF-κB p65mR

12、NA和蛋白質的表達能分別抑制51.3％，47.8％，并有時間和濃度依存性；流式細胞儀分析結果表明轉染靶向NF-κBp65-siRNA后，細胞的增殖活性被抑制；晚期凋亡率增加，進一步應用western blotting檢測抑凋亡蛋白iNOS、COX-2均表達顯示，瞬時轉染靶向NF-κB p65-siRNA后，iNOS、COX-2表達均下調；共聚焦結果顯示，NF-κB在胞核有分布。在體內(nèi)實驗亦表明，靶向NF-κB p65-siRNA能夠顯著

13、抑制裸鼠移植瘤的生長，誘導腫瘤細胞凋亡。免疫組化及RT-PCR，western blot分別檢測體內(nèi)NF-κB p65、iNOS、COX-2的mRNA和蛋白表達受明顯抑制率分別為42.3％，35.6％，36，1％；54.3％，55.6％，41.1％與對照組有統(tǒng)計學意義P＜0.05。 結論： NF-κB、iNOS及COX-2的表達與膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，隨著病情惡化，NF-κB、iNOS及COX-2的陽性率逐漸增加，

14、兩者呈正相關。應用免疫組化聯(lián)合檢測膽管癌組織中的NF-κB、iNOS及COX-2表達可能會有助于膽管癌的預后判斷。在膽管癌QBC939細胞中，靶向NF-κBp65的siRNA能夠有效抑制細胞增殖，加速細胞凋亡，同時導致iNOS、COX-2表達的下調。在膽管癌裸鼠移植瘤模型中，靶向NF-κBp65的siRNA能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，誘導腫瘤細胞凋亡。綜上所述，我們的實驗表明：NF-κB可能為靶向基因治療的潛在關鍵分子靶標；而靶向NF