觀賞花煙草(Nicotiana sanderae)VIGS體系構建與優(yōu)化.pdf

1、觀賞花煙草（Nicotianasanderae）是茄科煙草屬福吉特氏煙草（Nicotianaforgetiana）和花煙草（Nicotianaalata）的雜交種，花色艷麗且具有香味，十分適合進行花色花香基因功能的研究。為了搭建起大規(guī)模驗證觀賞花煙草新型花色花香基因功能的技術平臺，我們利用由煙草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus，TRV）構建而來的重組病毒載體，以八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoenedesaturase，PD

2、S)基因和查爾酮合酶(chalconesynthase，CHS)基因為報告基因，進行了觀賞花煙草病毒誘導基因沉默(Virus-inducedgenesilencing，VIGS)體系的初步構建與優(yōu)化，結果如下:
　　1、以PDS基因作為報告基因的試驗中，用根吸收法侵染觀賞花煙草浸種催芽至0.5～1cm長的幼根，種子點播后成活率均低于30％，且成活的樣本在其整個生命周期內均未出現(xiàn)過葉片光漂白的預期現(xiàn)象，證明根吸收法并不適用于誘導觀賞

3、花煙草的基因沉默;而常規(guī)播種養(yǎng)護至觀賞花煙草五葉期或六葉期再使用擴大培養(yǎng)濃度為OD600=1.1的農桿菌菌液制備侵染液，用葉背注射滲透法（注射器不帶針頭）向最內輪葉片葉背打入200～400μl侵染液進行葉片侵染，此后將植株置于光照培養(yǎng)箱中，先設定16h為25℃、8h為18℃在全黑暗條件下培養(yǎng)1天，再設定光溫周期為光照16h25℃/黑暗8h18℃進行常規(guī)養(yǎng)護，25天后處理組中表現(xiàn)出預期葉片光漂白現(xiàn)象的植株占到80％;
　　2、利用“

4、siRNAScan”篩選出能有效產生21ntsiRNA的CHS基因片段，用不依賴連接的克隆（Ligation-Independentcloning，LIC）法構建重組病毒載體pTRV2-CHS，檢測陽性率達100％;
　　3、以CHS基因作為報告基因的試驗中，采用前述VIGS技術體系進行葉片侵染及培養(yǎng)，注射侵染30天后或45天后（此時已入秋，氣溫不高于28℃）將植株從光照培養(yǎng)箱移至夜間加光3h的溫室大棚中，常規(guī)養(yǎng)護，植株開花后成功