草魚(Ctenopharyngodon idellus)Sp1的克隆及其表達研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子Sp1(Specificity protein 1)可調(diào)控多種基因的激活，參與多數(shù)細胞的生長分化和細胞周期代謝，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究利用T-A和RACE技術(shù)從草魚（Ctenopharyngodon idellus）腸道克隆出Sp1cDNA全序列，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了草魚不同組織、不同發(fā)育時期Sp1基因的表達，并探討了在日糧中添加不同蛋白源、不同蛋白水平和谷氨酰胺二肽等營養(yǎng)素對草魚Sp1基因表達的調(diào)控。

2、　　1、草魚Sp1cDNA克隆及生物信息學(xué)分析
　　草魚Sp1cDNA全長為1914bp，包括1482bp的編碼區(qū)、5bp的5'UTR和426bp的3'UTR，共編碼493個氨基酸。等電點為8.27，主要的元素成分含量為C:2.23％，N:4.87％，H:2.43％，S:9.94％，T:11.16％。分子式為C2237H3600N662O738S20。氨基酸組成中，Thr(11.2％)和Gln(10.1％)含量相對較高。氨基酸序列

3、的疏水性:MAX，2.93;MIN，-1.89。磷酸化位點:Ser21個，Thr7個，Tyr2個。系統(tǒng)進化分析表明Sp1在進化上比較保守，與鯉科魚中的斑馬魚(Daniorerio)親緣關(guān)系最近，同源性達66％。
　　2、草魚Sp1基因的時空表達
　　采用RT-qPCR檢測Sp1基因在草魚心臟、肝胰臟、脾臟、腎臟、肌肉、垂體、鰓、腦、前腸、中腸和后腸等組織的表達差異。結(jié)果表明:Sp1 mRNA在草魚中腸和鰓中表達最高，后腸和腦

4、次之，其余較低;胚胎發(fā)育過程中，共檢測10個時期Sp1mRNA相對表達量，出膜前的表達量明顯高于出膜后。出膜前各時期的表達量波動較大，原腸期和器官期表達顯著，囊胚期次之，出膜前期表達量降至最低，并在出膜后一直維持較低水平，只在出膜期第3天有短暫上調(diào)。
　　3、外源蛋白對草魚Sp1基因表達的影響
　　本實驗以體重為11.55±0.45g的健康草魚為研究對象，探討日糧中不同蛋白源和不同蛋白水平對草魚Sp1基因表達的影響。在不同蛋

5、白源實驗中，分別采用魚粉、豆粕和魚粉+豆粕作為飼料蛋白;在不同蛋白水平實驗中，分別在飼料中添加22％、27％、32％、37％和42％的粗蛋白。同時進行養(yǎng)殖實驗，并在養(yǎng)殖的第7d、第14d、第21d和第28d，采用RT-qPCR技術(shù)檢測中腸Sp1mRNA的相對表達量。
　　不同蛋白源實驗結(jié)果表明:隨著飼喂時間的延長，Sp1 mRNA表達量在3組實驗魚中均呈先升高后下降的趨勢，且均在飼喂21d時達到最高值。每個時期的表達量均為:混合組

6、＞魚粉組＞豆粕組。在第7d、第14d和第21d，混合組的表達量均顯著高于魚粉組和豆粕組，到28d時，魚粉組的表達量與混合組不再有顯著性差異。以上結(jié)果說明混合蛋白源對草魚Sp1的表達具有更強的上調(diào)作用，且魚粉優(yōu)于豆粕。
　　隨著飼喂時間的延長，日糧中添加不同蛋白水平對草魚腸道Sp1 mRNA表達量的影響表現(xiàn)出與不同蛋白源實驗相同的規(guī)律，即Sp1 mRNA表達量在飼喂5種不同蛋白水平飼料的實驗魚中均呈先升高后下降的趨勢，且均在飼喂21

7、d時達到最高值，說明Sp1 mRNA的表達與草魚的生長發(fā)育有一定關(guān)系。除第7d各組的Sp1mRNA表達量無差異外，每個時期均為27％粗蛋白添加組最高，且與其他組均有顯著性差異(p＜0.05)，而5個不同水平粗蛋白添加組相比，表現(xiàn)為:27％組＞22％組＞32％組＞37％組＞42％組，說明日糧中添加27％左右的粗蛋白可以更好地促進草魚腸道Sp1的表達，蛋白含量偏高或偏低都可能會起抑制作用。
　　4、谷氨酰胺二肽對草魚Sp1基因表達的影