酶聯(lián)免疫吸附法檢測馬傳染性貧血病毒核衣殼蛋白的聚合.pdf

1、一些蛋白質合成出來即具有生物學活性，但對于另一些蛋白質來說，翻譯完成后要經(jīng)過不同方式的加工修飾才能成為活性形式，二聚化或多聚化就是其中常見的加工方式。研究蛋白質聚合的常用方法有凝膠過濾層析法、非變性凝膠電泳法和動態(tài)光散射技術等。此外，研究蛋白-蛋白相互作用的方法，如酵母雙雜交、免疫共沉淀、pull down等，也可以用來鑒定蛋白質的聚合。這些方法應用廣泛，各有利弊。馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia vi

2、rus，EIAV)與人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)同屬于反轉錄病毒科慢病毒屬，是研究HIV的理想模型。EIAV的核衣殼蛋白(nucleocapsid，NC)能與病毒基因組結合，形成核酸-蛋白復合體，在病毒生活周期的各個階段發(fā)揮重要作用。核衣殼蛋白具有典型的CCHC型鋅指結構，具有這種結構的蛋白易于發(fā)生同源或異源聚合。
　　 本文對酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked im

3、munosorbent assay，ELISA)進行了改良，并將之應用于檢測馬傳染性貧血病毒核衣殼蛋白的聚合。首先構建了不帶FLAG標簽的和N-端或C-端融合有FLAG標簽的NC原核表達質粒pET28a-H-nc、pET28a-HF-nc和pET28a-H-nc-F，利用親和層析的方法對重組蛋白進行了純化，得到了純度較高的蛋白。然后將改良的酶聯(lián)免疫吸附法用于檢測NC的聚合：將NC包被于多孔板底，用帶FLAG標簽的NC與之結合，然后依次加

4、入抗-FLAG的單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗以及HRP的底物，終止反應后于450 nm波長下讀取吸收值以檢測蛋白是否發(fā)生聚合。
　　 本文還對NC聚合的特異性、劑量依賴效應和影響因素等進行了評價。利用改良的酶聯(lián)免疫吸附法，我們檢測到馬傳染性貧血病毒的NC可發(fā)生特異性聚合，且聚合程度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應，此外，我們還發(fā)現(xiàn)核酸能夠影響NC的聚合，而FLAG標簽的位置則對聚合沒有影響。這些結果為研究NC與核酸的相互作用