簡(jiǎn)介：ATHESISDISSERTATIONSUBMITTEDTOZHENGZHOUUNIVERS時(shí)FORTHEDEGREEOFMASTEREXPRESSION，PURIFICATIONOFZTAP54FUSIONPROTEININESCHERICHIACOLIOFEPSTEINBALLRVIRUSANDRESEARCHTHEDETECTIONMETHODSBYCHUNYANZHANGSUPERVISORPROF1YPUNLONGWANGBIOCHEMIST巧ANDMOLECULARBIOLOGYC01LEGEOFLIFESCIENCESMAY2014摘要摘要EB病毒與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)，該病毒以環(huán)狀DNA的形式整合在宿主細(xì)胞染色體上。由于鼻咽位置較深，早期病變?cè)谂R床常規(guī)體檢中不容易被發(fā)現(xiàn)，且CT等影像學(xué)診斷很難區(qū)分早期鼻咽癌與其它鼻咽增生性病變。因此，創(chuàng)傷小、成本低、檢測(cè)速度快的血清學(xué)診斷方法是目前鼻咽癌早期診斷研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。鑒于此我們擬通過(guò)表達(dá)鼻咽癌BZLFLBMⅪ71融合基因的蛋白抗原來(lái)建立檢測(cè)病人血清中EB病毒相關(guān)抗體，為鼻咽癌的早期診斷及廣譜篩查提供技術(shù)手段。本研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室PGEX5TBZLFLBMI強(qiáng)1質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果，利用PREMER50設(shè)計(jì)引物，從已有EB病毒抗原基因序列的質(zhì)粒上，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得目的基因片段，與載體PET32A連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET32A／BZLFLBMI江1，在大腸桿菌BL21DE3中表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDSPAGE分析蛋白可溶性、WESTENLBLOT檢測(cè)所表達(dá)蛋白的免疫原性，并通過(guò)優(yōu)化的硫酸銨沉淀、離子交換層析和親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記純化的ZTAP54融合蛋白，利用棋盤法確定重組抗原包被和酶標(biāo)抗體工作濃度，初步建立新的鼻咽癌診斷及篩查ELISA方法，對(duì)其進(jìn)行特異性、精密性和臨床分析。結(jié)果表明1成功構(gòu)建重組質(zhì)粒PET32彩BZLFLBMI江1實(shí)現(xiàn)了ZTAP54融合蛋白的可溶性表達(dá)；2建立了該抗原的優(yōu)化純化程序，純度可達(dá)965％；3利用所表達(dá)蛋白初步建立了鼻咽癌ELISA間接檢測(cè)方法與臨床診斷結(jié)果符合率較高，有望用于鼻咽癌前期輔助診斷及大規(guī)模篩查，同時(shí)，為鼻咽癌特異性血清學(xué)診斷方法的建立提供了借鑒。關(guān)鍵詞EB病毒鼻咽癌ZTAP54融合蛋白原核表達(dá)蛋白純化ELISA檢測(cè)

簡(jiǎn)介：EB病毒BARFL原型和變異型基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響中文摘要背景和目的EB病毒EPSTEINBARRVIRUS，EBV編碼早期基因BARFL是新近確立的EBV致癌基因之一，其轉(zhuǎn)化作用已在多種細(xì)胞系中得到證實(shí)。由于BARFL在多數(shù)鼻咽癌NASOPHARYNGEALCARCINOMA，NPC和EBV相關(guān)胃癌組織中表達(dá)，推測(cè)其可能在NPC、胃癌等上皮細(xì)胞性腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。我們前期在檢測(cè)BARFL基因多態(tài)性時(shí)發(fā)現(xiàn)V29A變異型在NPC中的檢出率高于健康人群。本研究旨在探討B(tài)ARFL基因?qū)PC細(xì)胞系腫瘤原性的影響以及BARFL基因變異型對(duì)其致癌潛能的影響，為研究BARFL參與NPC的作用及機(jī)制提供依據(jù)。方法構(gòu)建BARFL基因原型B958和變異型V29A慢病毒表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染EBV陰性NPC細(xì)胞系CNE，殺稻瘟菌素篩選，RTPCR和QRTPCR鑒定目的基因表達(dá)獲得BARFL原型和變異型基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)BARFL原型和變異型基因?qū)NE細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果1成功構(gòu)建BARFL基因原型和變異型基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，2種基因在EBV陰性NPC細(xì)胞系中均能有效表達(dá)。2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)BARFL原型和變異型基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞MTT吸光度值、平板克隆形成率和細(xì)胞周期細(xì)胞增殖指數(shù)均無(wú)顯著性差異P均大于O05。3凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)順鉑299／M1誘導(dǎo)48H，感染BARFL原型和變異型慢病毒細(xì)胞的存活率均高于對(duì)照病毒感染細(xì)胞，差異有顯著性P均小于005，而細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照病毒感染細(xì)胞，差異有顯著性P均小于005，變異型與原型之間細(xì)胞存活率和凋亡率均無(wú)顯著性差異P均大于005。4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)BARFL原型和變異型慢病毒感染細(xì)胞的遷移能力高于對(duì)照病毒感染細(xì)胞，差異有顯著性氏005，變異型與原型之間細(xì)胞遷移無(wú)顯著性差異尸005。結(jié)論1BARFL基因?qū)BV陰性NPC細(xì)胞系CNE無(wú)明顯促增殖作用，但可提高其抗凋亡能力和遷移能力，從而增強(qiáng)CNE細(xì)胞腫瘤原性，在NPC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起重要作用。2BARFLV29A變異型對(duì)BARFL致癌潛能無(wú)明顯影響。碩士研究生楊穎病原生物學(xué)指導(dǎo)老師羅兵教授關(guān)鍵詞EB病毒；BARFL；鼻咽癌；細(xì)胞生物學(xué)行為BETWEENPROTOTYPEANDVARIANTBARF1一EXPRESSINGCELLSWASNOTSIGNIFICANTINCELLVIABILITYANDAPOPTOSISRATE胗0054THEPROTOTYPEBARF1一EXPRESSINGCELLSANDVARIANTBARF1EXPRESSINGCELLSLEDTOSTRONGERMIGRATIONCAPABILITYTHANTHENONEXPRESSINGCELLS尸005CONCLUSION1BARFLGENEHASNOSIGNIFICANTEFFECTONTHEPROLIFERATIONOFEBVNEGATIVENPCCELLLINECNE，BUTITCANINCREASEITSANTIAPOPTOSISANDMIGRATIONABILITIES，SUGGESTINGBARF1ENHANCETHEONCOGENICABILITYINCNECELLSANDMAYPLAYIMPORTANTROLESINTHEDEVELOPMENTANDPROGRESSOFNPC2THEV29AVARIANTOFBARF1HASNOSIGNIFICANTEFFECTONCARCINOGENICABILITYOFBARF1GENEPOSTGRADUATESTUDENTYINGYANGPATHOGENBIOLOGYDIRECTEDBYPROFBINGLUOKEYWORDSEPSTEINBARRVIRUS；BARFL；NASOPHARYNGEALCARCINOMA；CELLBIOLOGICALBEHAVIOR

簡(jiǎn)介：乙肝病毒PRE0區(qū)、C啟動(dòng)Z區(qū)、PRES2區(qū)基因突變與肝臟疾病相關(guān)性的研究研究背景乙肝病毒感染者可引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、重癥肝炎和無(wú)癥狀的HBV攜帶狀態(tài)。除了與宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)，肝炎病毒本身的變異也是一個(gè)重要因素。HBV變異與臨床的關(guān)系是乙型肝炎研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)HBVPREC區(qū)NTL896位GA、CP區(qū)NTL762AT、NTL764GA突變株感染是引起部分病人暴發(fā)性肝炎和慢性肝炎病情加重的原因之一。而PRES2區(qū)起始密碼變異和缺失變異與肝炎病情輕重的關(guān)系也引起人們極大關(guān)注。我們的實(shí)驗(yàn)是在以上研究的基礎(chǔ)上對(duì)慢性無(wú)癥狀HBV攜帶者、慢乙肝、肝硬化三組病人的HBV基因進(jìn)行PREC區(qū)、CP區(qū)、PRES2區(qū)三個(gè)區(qū)域變異進(jìn)行檢測(cè)，以期研究其與肝病病情進(jìn)展是否有關(guān)。另外，這三個(gè)區(qū)域的三重聯(lián)合變異也是我們實(shí)驗(yàn)的較新之處。目的研究乙型肝炎病毒HBVPREC區(qū)1896位GA、C啟動(dòng)子CP1762和1764位雙突變、以及PRES2區(qū)基因突變與HBV不同感染狀態(tài)的關(guān)系，探討其臨床意義。方法對(duì)53例慢性無(wú)癥狀乙肝病毒攜帶者、50例慢乙肝患者、43例肝硬化病人進(jìn)行血清DNA擴(kuò)增PCR法，經(jīng)瓊脂糖電泳后，將C基因和PRES2基因同時(shí)陽(yáng)性者用雙脫氧測(cè)序法檢測(cè)這三組病人HBVDNA的PREC區(qū)1896位、CP區(qū)1762和1764位、PRES2區(qū)基因突變的情況，比較三組病人的上述三個(gè)區(qū)域的突變率、比較慢乙肝組按病情輕重分類的變異情況、比較所有病人按HBEAG陽(yáng)性HBEAG陰性分類的三個(gè)區(qū)域的變異情況、比較肝硬化組按CHILD分級(jí)分類的三個(gè)區(qū)域的變異情況。結(jié)果在不同臨床類型的感染者中，PREC區(qū)、CP區(qū)變異檢出率以肝硬化組最高8／18，16／18，其次為慢乙肝組9／26，346％19／26，731％，再次為慢性攜帶者組0／16，O％；3／16，188％，前兩組分別同慢性攜帶者組相比差異有顯著性意義G00001；00007，而慢乙肝組與肝硬化組彼此之間的差異無(wú)顯著性意義P02063。PRES2區(qū)缺失變異也以肝硬化組最高3／18，其次為慢乙肝組4／26，而慢性攜帶者組未發(fā)現(xiàn)PRES2區(qū)缺失突變。但二組的缺失突變率與慢性攜帶者相比差異無(wú)顯著意義。另外，就PREC區(qū)1896位與CP區(qū)1762、1764位雙重聯(lián)合變異率來(lái)看，肝硬化組7／18高于慢乙肝組6／26，并且明顯高于慢性攜帶者組，差異有顯著意義PO0058；PO0403。PREC區(qū)、CP區(qū)、PRES2區(qū)三重變異率在慢性攜帶者組為O，而在慢乙肝組和肝硬化組各L例。另外還發(fā)現(xiàn)一些CP區(qū)其他位點(diǎn)變異如G1777A、T1721G、G1729A等。結(jié)論前C區(qū)1896位、CP區(qū)1762和1764位突變普遍存在于慢乙肝和肝硬化病人中，而非慢性攜帶者中，其中以CP區(qū)變異率更高，因此，HBV這三個(gè)區(qū)域的變異尤其是CP區(qū)變異可作為慢性無(wú)癥狀攜帶者隨訪的重要指標(biāo)，可作為病情發(fā)展的預(yù)示信號(hào)。肝硬化患者突變率與慢乙肝無(wú)顯著差異，說(shuō)明肝臟病程慢性肝病的進(jìn)展與病毒本身變異的關(guān)系可能不大。

簡(jiǎn)介：流感病毒INFLUENZAVIRUS表面糖蛋白神經(jīng)氨酸酶NEURAMINIDASENA在其生命周期中起重要作用主要作用為促進(jìn)子代流感病毒顆粒從宿主細(xì)胞釋放。本文以2009年出現(xiàn)的新型甲型H1N1流感病毒ACALIFNIA042009H1N1簡(jiǎn)稱CA04及一株普通流感病毒APUERTORICO834H1N1簡(jiǎn)稱PR8的神經(jīng)氨酸酶為靶點(diǎn)建立野生型與達(dá)菲耐藥型CA04H275YN295SE119VR293K；PR8H260YN280SE104VR278K酶學(xué)水平與細(xì)胞水平藥物評(píng)價(jià)體系。酶學(xué)水平評(píng)價(jià)模型是將表達(dá)NA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)后直接裂解細(xì)胞作為NA酶原液與化合物作用后加入NA特異性底物4MUNANA并溫孵通過(guò)熒光檢測(cè)法測(cè)定其產(chǎn)物4MU的生成量來(lái)反映化合物對(duì)NA的抑制作用。細(xì)胞水平評(píng)價(jià)模型應(yīng)用重組病毒技術(shù)將表達(dá)流感病毒血凝素蛋白HEMAGGLUTININHAAVIETNAM12032004H5N1的質(zhì)粒、表達(dá)NA的質(zhì)粒以及表達(dá)敲除外殼基因并帶有熒光素酶報(bào)告基因的HIV1基因組共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞產(chǎn)生以HA、NA為外殼蛋白包裹HIV1核心的重組病毒；在病毒釋放環(huán)節(jié)前加入不同濃度的化合物后收集病毒上清感染A549細(xì)胞通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性計(jì)算病毒感染率來(lái)反映病毒釋放量從而反映出化合物對(duì)重組病毒NA的抑制作用。模型經(jīng)用陽(yáng)性藥物達(dá)菲及其羧酸活性形式以及扎那米韋驗(yàn)證結(jié)果顯示對(duì)于NACA04及其耐藥株酶學(xué)水平模型達(dá)菲羧酸和扎那米韋對(duì)NACA04WILDTYPE的IC50分別為104±0043NMOLL1和0368±0042NMOLL1對(duì)NACA04H275Y的IC50分別為173±513NMOLL1和0263±0194NMOLL1對(duì)NACA04N295S的IC50分別為804±104NMOLL1和171±0650NMOLL1對(duì)NACA04E119V的IC50分別為784±233NMOLL1和116±415NMOLL1R293K突變型不具備建立藥模型的條件；細(xì)胞水平模型中三種藥物對(duì)NACA04WILDTYPE的IC50分別為509±300NMOLL1、531±176NMOLL1和417±242NMOLL1對(duì)NACA04H275Y的IC50分別為2737±2250NMOLL1、248±165NMOLL1和164±0962NMOLL1對(duì)NACA04N295S的IC50分別為3957±1639NMOLL1、258±171NMOLL1和300±224NMOLL1對(duì)NACA04E119V的IC50分別為804±207NMOLL1、703±340NMOLL1和537±870NMOLL1R293K突變型不具備建立藥模型的條件；對(duì)于NAPR8及其耐藥株酶學(xué)水平模型達(dá)菲羧酸和扎那米韋對(duì)NAPR8WILDTYPE的IC50分別為134±0731NMOLL1和0584±0142NMOLL1對(duì)NAPR8H260Y的IC50分別為181±350NMOLL1和0607±0312NMOLL1對(duì)NAPR8N280S的IC50分別647±190NMOLL1和152±0489NMOLL1E104V和R278K不具備建立藥模型的條件；細(xì)胞水平模型三種藥物對(duì)NAPR8WILDTYPE的IC50分別為896±529NMOLL1、0616±0229NMOLL1和0495±0384NMOLL1對(duì)NAPR8H260Y的IC50分別為6257±2087NMOLL1、298±471NMOLL1和0529±0266NMOLL1對(duì)NAPR8N280S的IC50分別為650±654NMOLL1、403±354NMOLL1和0760±0215NMOLL1E104V和R278K突變型不具備建立藥模型的條件。所得結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道相符。本文應(yīng)用模型對(duì)約1500個(gè)化合物和14種中藥組分進(jìn)行了初篩評(píng)價(jià)得到11個(gè)活性化合物半數(shù)抑制濃度均小于100ΜMOLL1。綜上所述本研究系統(tǒng)建立了以甲型流感病毒NA為靶點(diǎn)的細(xì)胞和酶學(xué)水平的野生型及耐藥型可用于化合物篩選及藥物評(píng)價(jià)的模型應(yīng)用所建模型進(jìn)行了化合物篩選并得到活性化合物根據(jù)模型實(shí)驗(yàn)對(duì)NA及其耐藥型的特性進(jìn)行了初步探討。

簡(jiǎn)介：目的本研究通過(guò)調(diào)查沈陽(yáng)市鐵西區(qū)社區(qū)老年人代謝綜合征和輕度認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率及其分布情況。探討社區(qū)老年人代謝綜合征與輕度認(rèn)知功能障礙之間的關(guān)系，探討代謝綜合征及其組分對(duì)社區(qū)老年人認(rèn)知功能的影響情況，分析社區(qū)老年代謝綜合征患者認(rèn)知功能的受損特點(diǎn)。有利于及早發(fā)現(xiàn)存在輕度認(rèn)知功能障礙的高危人群，并針對(duì)危險(xiǎn)因素采用早期干預(yù)等手段。從而為改善社區(qū)老年代謝綜合征人群的認(rèn)知功能狀況，提高社區(qū)老年代謝綜合征人群的生活質(zhì)量提供實(shí)踐依據(jù)。方法本研究于2011年2012年采用整群隨機(jī)抽樣方法，抽取沈陽(yáng)市鐵西區(qū)下屬四個(gè)社區(qū)。在這四個(gè)社區(qū)中，通過(guò)分層隨機(jī)抽樣，在902名社區(qū)老人中抽取360名老年人作為研究對(duì)象。實(shí)際完成調(diào)查247例。采用簡(jiǎn)明精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表MOCA對(duì)老年人進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)價(jià)，使用SPSS180軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1沈陽(yáng)市鐵西區(qū)社區(qū)老年人代謝綜合征發(fā)生率為101％2代謝綜合征MS組和非代謝綜合征NMS組和對(duì)照NC組的輕度認(rèn)知功能障礙MCI發(fā)生率分別為240％、173％、157％3三組在MMSE總分、MMSE即刻回憶、MMSE計(jì)算、MMSE復(fù)述、MMSE三步命令、MOCA總分、MOCA視空間結(jié)構(gòu)、MOCA注意力、MOCA重復(fù)句子和MOCA抽象力等方面的評(píng)分存在差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0054三組在MMSE定向力（包括空間定向和時(shí)間定向）、MMSE延遲回憶、MMSE命名、MMSE書寫、MMSE畫圖、MOCA命名、MOCA流暢性、MOCA延遲回憶和MOCA定向力等方面差異無(wú)顯著性意義P＞0055舒張壓、代謝綜合征MS與認(rèn)知功能呈負(fù)相關(guān)，舒張壓、代謝綜合征是影響社區(qū)老年人認(rèn)知功能的重要危險(xiǎn)因素。結(jié)論1社區(qū)老年人代謝綜合征MS與輕度認(rèn)知功能障礙MCI之間存在相關(guān)性2社區(qū)老年代謝綜合征MS患者輕度認(rèn)知功能障礙MCI的發(fā)生率高于非代謝綜合征NMS及對(duì)照NC組老年人群3代謝綜合征MS組、非代謝綜合征NMS組與對(duì)照NC組相比，存在即刻回憶、計(jì)算、復(fù)述、三步命令、視空間結(jié)構(gòu)、注意力、重復(fù)句子和抽象力等方面等八個(gè)方面認(rèn)知功能的下降4舒張壓、代謝綜合征與社區(qū)老年人的認(rèn)知功能水平呈負(fù)相關(guān)，這兩個(gè)因素是影響社區(qū)老年人認(rèn)知功能狀況的重要危險(xiǎn)因素。

簡(jiǎn)介：目的人巨細(xì)胞病毒HUMANCYTOMEGALOVIRUS，HCMV感染在人群中普遍存在，可引起新生兒多種畸形和疾病，也可引起免疫低下患者的致死性感染，其危害巨大。有學(xué)者推測(cè)HCMVULB區(qū)可能在病毒的復(fù)制、潛伏和對(duì)宿主的致病性方面起重要作用，因而ULB區(qū)基因及編碼蛋白在HCMV感染和致病性方面受到特殊關(guān)注。位于HCMVULB區(qū)內(nèi)的UL141基因，其編碼產(chǎn)物是糖蛋白雙聯(lián)體，分子量在3740KDA之間。目前已知其編碼蛋白能夠抑制細(xì)胞表面CD155，CD122，TRAILR1以及TRAILR2的表達(dá)，從而逃避NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用。本文從酵母雙雜交篩選、PULLDOWN、激光共聚焦技術(shù)、免疫共沉淀等技術(shù)篩選并鑒定HCMVUL141編碼蛋白與胎腦文庫(kù)組織相互作用的蛋白以及相互作用蛋白對(duì)HCMV復(fù)制的影響。以上研究將有利于闡明病毒基因在致病和復(fù)制中的功能，進(jìn)而深入理解HCMV的感染機(jī)制。實(shí)驗(yàn)材料與方法一、實(shí)驗(yàn)材料標(biāo)本來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒室保存的臨床低傳代HCMV分離株H株（傳代次數(shù)＜5次）。MATCHMAKERGALTWOHYBRIDSYSTEM購(gòu)自CLONTECH公司JAPAN。人胎腦CDNA文庫(kù)由武漢大學(xué)生命科學(xué)院肖庚富教授惠贈(zèng)。MAGNEGSTTMPULLDOWNSYSTEM試劑盒購(gòu)于PROMEGA公司USA。PROFOUNDCMYCTAGIPCOIPKIT，PROFOUNDHATAGIPCOIPKIT試劑盒購(gòu)于THERMOSCIENTIFIC公司USA。LIPOFECTAMINE2000LIPOFECTAMINERNAIMAXREAGENT購(gòu)于INVITROGEN公司。細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于TIANGEN公司。POWERSYBRGREENPCRMASTERMIN購(gòu)于LIFETECHNOLOGIES公司USA。引物合成及測(cè)序由INVITROGEN公司SHANGHAI，CHINA完成。常用數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件如基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(kù)、引物設(shè)計(jì)軟件等。二、實(shí)驗(yàn)方法（一）酵母雙雜交篩選1、以HCMVH株的DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增獲得UL141基因片段，將SFIⅠ和SALⅠ酶切后的UL141基因片段連接至同時(shí)酶切的PGBKT7載體上，構(gòu)建PGBKT7UL141重組質(zhì)粒，PCR鑒定，并測(cè)序分析驗(yàn)證。2、將PGBKT7UL141重組質(zhì)粒與人胎腦EDNA文庫(kù)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109中，涂布于二缺（SDLEUTRP）及四缺（SDLEUTRPHISADE）培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出，以XGAL篩選藍(lán)色的陽(yáng)性克隆。3、提取陽(yáng)性克隆的酵母質(zhì)粒，電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中，在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中篩選出含CDNA文庫(kù)的陽(yáng)性克隆。進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，觀察其在四缺培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況。4、鑒定后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)GENBANK生物信息學(xué)軟件進(jìn)行BLAST分析。（二）PULLDOWN技術(shù)鑒定1、利用ECⅠ和XHOⅠ兩種限制性內(nèi)切酶，酶切文庫(kù)質(zhì)粒PACT2CELF5，克隆到同時(shí)雙酶切的含有GST標(biāo)簽的PGEX4T2載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEXCELF5。2、利用TNT體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，將PGBKT7UL141重組質(zhì)粒作為捕獲蛋白進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄提取在大腸桿菌中表達(dá)的PGEXCELF5蛋白，作為誘餌蛋白將其固相化到MAGNEGSTTMPARTICLES上，按照MAGNEGSTTMPULLDOWNSYSTEM操作進(jìn)行，將兩種蛋白共同孵育，洗脫，純化，WESTERNBLOT技術(shù)分析相互作用的蛋白復(fù)合物，電化學(xué)發(fā)光法鑒定結(jié)果并分析。（三）激光共聚焦技術(shù)的細(xì)胞定位分析1、將含有ECⅠ和BAMHⅠ粘性末端的UL141基因片段，克隆到同時(shí)雙酶切的含有綠色免疫熒光標(biāo)記的PEGFPC1載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒PEGFPUL141采用同樣的方法將篩選得到的文庫(kù)質(zhì)?？寺〉胶屑t色免疫熒光標(biāo)記的PDSREDC1載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒PDSREDCELF5，并測(cè)序分析驗(yàn)證。2、培養(yǎng)人胚腎293T細(xì)胞。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將PEGFPUL141和PDSREDCELF5共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察兩種蛋白表達(dá)及定位情況。（四）COIMMUNOPRECIPITATION技術(shù)鑒定1、利用SFIⅠ和NOTⅠ兩種限制性內(nèi)切酶，酶切質(zhì)粒PGBKT7UL141，克隆到同時(shí)雙酶切的PCMVMYC載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒PCMVMYCUL141利用ECⅠ和XHOⅠ兩種限制性內(nèi)切酶，采用同樣的方法將篩選得到的文庫(kù)質(zhì)?？寺〉絇CMVHA載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒PCMVHACELF5，并測(cè)序分析驗(yàn)證。2、培養(yǎng)人胚腎293T細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將PCMVUL141和PCMVCELF5共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后裂解細(xì)胞并提取上清，按照PROFOUNDCMYCTAGIPCOIPKIT及PROFOUNDHATAGIPCOIPKIT操作說(shuō)明，將上清分別與含有CMYC及HA抗體的瓊脂糖孵育，洗脫，最后采用WESTERNBLOT技術(shù)分析相互作用的蛋白復(fù)合物，電化學(xué)發(fā)光法分析、鑒定結(jié)果。（五）實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析蛋白功能1、培養(yǎng)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U373MG細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將PCMVCELF5、SIRNACELF5、CSIRNA分別轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)373MG細(xì)胞中，提取相應(yīng)細(xì)胞蛋白，WESTERNBLOT技術(shù)分析過(guò)表達(dá)及干擾CELF5的結(jié)果。2、上述細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后感染HCMV，感染48小時(shí)后收集細(xì)胞提取相應(yīng)細(xì)胞DNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分別檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞中HCMVDNA的相對(duì)量。結(jié)果一、酵母雙雜交1、用特異性引物成功擴(kuò)增出HCMVUL141基因片段，片段長(zhǎng)度為1017BP并成功將其克隆到酵母系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄結(jié)合域PGBKT7載體上，命名為PGBKT7UL141，測(cè)序分析顯示結(jié)果與預(yù)期一致。測(cè)序結(jié)果表明融合區(qū)域的讀碼框正確，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為HCMVUL141序列且無(wú)堿基突變。2、將PGBKT7UL141重組質(zhì)粒與人胎腦CDNA文庫(kù)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞AH109中，經(jīng)過(guò)重復(fù)篩選從SDADEHISLEUTRP平板篩選出24個(gè)陽(yáng)性克隆。3、對(duì)驗(yàn)證后陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序和生物信息學(xué)分析共獲得以下6個(gè)候選基因CHD3，編碼人染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白3DNAJB1，編碼熱休克蛋白40亞族B1DACH1，編碼人細(xì)胞命運(yùn)決定因子TLE1，編碼轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白樣增強(qiáng)子1WTIP，編碼腎母細(xì)胞瘤相互作用蛋白1CELF5，編碼人胚胎致死異常視覺家族蛋白5，其中篩選的陽(yáng)性克隆與CELF5高度同源，同源性100％。二、PULLDOWN技術(shù)鑒定1、將文庫(kù)質(zhì)粒PACT2CELF5用EC1和XHO1酶切后克隆到含有GST標(biāo)簽的PGEX4T2載體上，PCR鑒定，測(cè)序分析，克隆成功。2、將重組質(zhì)粒PGEXCELF5轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，CELF5融合蛋白成功表達(dá)。3、按照MAGNEGSTTMPULLDOWNSYSTEM操作，通過(guò)WESTERNBLOT的方法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種蛋白在體外發(fā)生直接的相互作用。三、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)鑒定1、采用EC1和BAMH1限制性內(nèi)切酶，構(gòu)建重組質(zhì)粒PEGFPUL141和PDSREDCELF5，PCR鑒定，測(cè)序分析顯示克隆成功。2、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將上述兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至生長(zhǎng)狀態(tài)良好的具有75％融合度的人胚腎293T細(xì)胞中，48小時(shí)后，通過(guò)共聚焦顯微鏡，利用488NM波長(zhǎng)和543NM波長(zhǎng)激光束觀察蛋白分布，觀察到HCMVUL141編碼蛋白與CELF5編碼蛋白共定位于細(xì)胞質(zhì)。四、免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步鑒定1、分別采用SFIⅠ、NOTⅠ以及ECⅠ、XHOⅠ兩對(duì)限制性內(nèi)切酶，構(gòu)建重組質(zhì)粒PCMVMYCUL141和PCMVHACELF5，PCR鑒定，測(cè)序分析顯示克隆成功。2、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將上述兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至生長(zhǎng)狀態(tài)良好的具有90％融合度的人胚腎293T細(xì)胞中，24小時(shí)后收集并裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，將上清分別與含有CMYC及HA抗體的瓊脂糖孵育，經(jīng)洗脫，最后通過(guò)CMYC及HA抗體進(jìn)行WESTERNBLOT檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種蛋白在體內(nèi)發(fā)生相互作用。五、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析蛋白功能1、培養(yǎng)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U373MG細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將PCMVHACELF5、SIRNACELF5、CSIRNA分別轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)373MG細(xì)胞中，提取相應(yīng)細(xì)胞蛋白，通過(guò)CELF5抗體進(jìn)行WESTERNBLOT檢測(cè)，結(jié)果顯示在U373MG細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)及干擾CELF5。2、上述細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24H后感染HCMV，感染48小時(shí)后收集細(xì)胞提取相應(yīng)細(xì)胞DNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分別檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞中HCMVDNA的相對(duì)量，結(jié)果提示過(guò)表達(dá)CELF5能夠促進(jìn)HCMV的復(fù)制，干擾CELF5的表達(dá)對(duì)HCMV的復(fù)制沒(méi)有明顯影響。結(jié)論應(yīng)用酵母雙雜交初步篩選出HCMVUL141蛋白和人胎腦文庫(kù)蛋白CELF5發(fā)生相互作用，通過(guò)PULLDOWN、免疫共沉淀以及激光共聚焦實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這兩種蛋白間的相互作用并共同定位于細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)CELF5的過(guò)表達(dá)促進(jìn)HCMV的復(fù)制，因此在HCMV感染過(guò)程中，UL141編碼蛋白可能通過(guò)與CELF5的相互作用，促進(jìn)HCMV的復(fù)制。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)H0密級(jí)無(wú)學(xué)校代碼10414學(xué)號(hào)2013010484碩士研究生學(xué)位論文碩士研究生學(xué)位論文THECOGNITIVESEMANTICANALYSISOFFIGURATIVECLASSIFIERNOUNSTRUCTURESINMARINCHINESE漢語(yǔ)喻性名量搭配的認(rèn)知語(yǔ)義分析漢語(yǔ)喻性名量搭配的認(rèn)知語(yǔ)義分析白黎白黎院所外國(guó)語(yǔ)學(xué)院導(dǎo)師姓名李勇忠學(xué)位類別學(xué)術(shù)型碩士專業(yè)領(lǐng)域語(yǔ)言學(xué)二〇一六年六月IABSTRACTCLASSIFIERSASADISTINCTFEATUREOFSINOTIBETANLANGUAGESAREEMPLOYEDWIDELYVARIOUSLYINMODERNMARINCHINESEASFTHEIGINSOFCLASSIFIERSTHELEXICALITEMSTHEYMOSTFREQUENTLYCOLLOCATEWITHCLASSIFIERSARECLOSELYRELATEDTONOUNSINCONSEQUENCETHESTUDIESOFCLASSIFIERNOUNSTRUCTURESFROMDIFFERENTANGLESHAVEBEENACCUMULATINGTOALARGEAMOUNTTILLNOWTHEINCREASINGSURGEOFCOGNITIVELINGUISTICSHASBEENGENERALLYPROMOTINGTHERESEARCHOFCLASSIFIERNOUNSTRUCTURESFROMDEIONTOINTERPRETATIONPROVIDINGARENEWEDPERSPECTIVETOLANGUAGECOGNITIONEXPLINGTHEPROCESSINGMECHANISMSOFRELEVANTLINGUISTICPHENOMENATHEBASICFMOFCHINESECLASSIFIERNOUNSTRUCTURESIS“NUMERALCLASSIFIERNOUN”WHICHISCOMPOSEDINACOGNITIVESEMANTICCOMPOSITIONALWAYACCDINGTOTHESTARDSOFCOMPOSITIONALITYSEMANTICTRANSPARENCYWEIDENTIFYFIGURATIVECLASSIFIERNOUNSTRUCTURESFROMLITERALONESTHISTHESISISTHECOGNITIVESEMANTICSTUDYOFFIGURATIVECLASSIFIERNOUNSTRUCTURESBASEDONCOGNITIVESEMANTICSINTHETESOFCOGNITIVESEMANTICSWESEETHATTHEREISNOCLEARCUTDEMARCATIONBETWEENLITERALLANGUAGEFIGURATIVELANGUAGESOISTHATOFLITERALFIGURATIVECLASSIFIERNOUNSTRUCTURESASFFIGURATIVECLASSIFIERNOUNSTRUCTURESPERSETHEREPRESENTATIVEMEMBERSMETAPHICALMETONYMICALCLASSIFIERNOUNSTRUCTURESAREASSUMEDTOBEDIFFERENTPARTSINTHESAMESEMANTICCLINETOEXAMINETHISASSUMPTIONWECONSIDERTHEEMERGENTFIGURATIVEMEANINGOFCLASSIFIERNOUNSTRUCTURESASACONSEQUENCEOFRECATEGIZATIONONSEMANTICLEVELTHENAROUNDOFDISCUSSIONHASBEENHELDVIACONCEPTUALMETAPHTHEYCONCEPTUALMETONYMYTHEYCONCEPTUALBLENDINGTHEYTHETHEYOFLEXICALCONCEPTSCOGNITIVEMODELSIELCCMTHEYMETAPHICMETONYMICMODELSPRIMARILYINTERPRETMETAPHICALMETONYMICALCLASSIFIERNOUNSTRUCTURESBUTTHEBIDIRECTIONALMAPPINGSBETWEENTHENOUNSCLASSIFIERSCANNOTBEREFLECTEDNEITHERTHENATUREOFONLINEMEANINGCONSTRUCTIONCONCEPTUALBLENDINGTHEYMIRRSTHESPECIFIEDINTERACTIONOFTHENOUNSCLASSIFIERSINREALTIMESITUATIONSWHICHOFFSETSTHOSESHTCOMINGSWHATISMEWEALSODEPLOYLCCMTHEYTOMAKETHECOGNITIVECOMPOSITIONALRELATIONBETWEENTHENOUNSCLASSIFIERSAPPARENTTOSHOWTHEINTERACTIONBETWEEN

簡(jiǎn)介：分類號(hào)風(fēng)臉單位代碼學(xué)號(hào)，洋聲么沁，，少夕夕‘第茸碩士學(xué)位論文勁刀乙石泣汀擬恤污勁論文題目，耘盛布執(zhí)人劍喊肴湯么加礴妞望才堿昏浪耐私瓢叫作者姓名指導(dǎo)教師姓名專業(yè)技術(shù)職務(wù)，‘年斗月“日山東人學(xué)碩卜學(xué)位論文腺病毒介導(dǎo)的人骨形成蛋白一一基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)骨膜牽張成骨的實(shí)驗(yàn)研究碩士研究生葉展超專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)導(dǎo)師魏奉才教授摘要目的探討骨膜牽張成骨新技術(shù)，為牙槽骨缺損及其它骨缺損尋找新的修復(fù)方法，并通過(guò)在骨膜牽張成骨的模型上局部應(yīng)用一一，評(píng)價(jià)其在骨膜牽張成骨過(guò)程中的作用，以尋找一種縮短骨膜牽張成骨療程的新方法。方法實(shí)驗(yàn)一，選用只成年雄性新西蘭大白兔，將自制的骨膜牽張成骨裝置牢固固定在兔的一側(cè)下領(lǐng)骨體部外側(cè)面，術(shù)后原位固定，于術(shù)后第對(duì)術(shù)側(cè)下領(lǐng)骨骨膜牽張兩次，每次。從術(shù)后第開始每牽張，連續(xù)牽張，最終將骨膜牽離骨面。另一側(cè)未手術(shù)的下領(lǐng)骨作為空白對(duì)照側(cè)。于術(shù)后第，、和隨機(jī)處死只動(dòng)物。取下領(lǐng)骨標(biāo)本，并通過(guò)線攝片、組織學(xué)檢查和新生骨量分析觀察牽張間隙新骨形成的情況。實(shí)驗(yàn)二，選用成年雄性新西蘭大白兔只，隨機(jī)分為兩組，每組只。按實(shí)驗(yàn)一所述方法建立下領(lǐng)骨骨膜牽張成骨的動(dòng)物模型并進(jìn)行牽張，術(shù)后動(dòng)物下領(lǐng)骨于原位固定，于術(shù)后第對(duì)術(shù)側(cè)下頒骨骨膜牽張兩次，每次。然后隨機(jī)選取一組動(dòng)物，在牽張側(cè)牽張間隙內(nèi)注射川滴度為’場(chǎng)的一一病毒液，為一一治療組另外一組只未注射一一病毒液，為單純骨膜牽張組。從術(shù)后第開始每牽張，連續(xù)。術(shù)后第，骨膜被牽離骨面共。分別于術(shù)后、、和，隨機(jī)處死只動(dòng)物，包括只一一組和只單純牽張組。取動(dòng)物標(biāo)本行線攝片、組織學(xué)檢查和新生骨量分析，結(jié)果采用兩樣本均數(shù)比較的檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多男青少年外生殖器發(fā)育疾患現(xiàn)狀與生理保健認(rèn)知行為需求調(diào)查.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了攜突變型HIF1Α基因的重組腺病毒載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染體外誘導(dǎo)培養(yǎng)HMSCS，研究HIF1Α表達(dá)或增強(qiáng)其表達(dá)后對(duì)5AZA誘導(dǎo)HMSCS成為心肌樣細(xì)胞過(guò)程的影響，以進(jìn)一步明確HIF1Α的心臟保護(hù)活性，為進(jìn)一步研究HIF1Α基因及其突變型對(duì)缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本課題分四個(gè)部分進(jìn)行研究。方法第一部分本課題組所構(gòu)建的重組腺病毒載體HIF1Α、ADHIF1Α、ADHIF1Α和ADHIF1Α連同對(duì)照病毒ADLACZ，在HEK293細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增后終點(diǎn)稀釋實(shí)驗(yàn)法測(cè)定病毒滴度，再經(jīng)氯化銫梯度離心法純化；采用PCR方法對(duì)純化后病毒所攜突變型HIF1Α基因進(jìn)行完整性鑒定；采用掃描電鏡對(duì)純化后病毒進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；以ADLACZL感染HEK293細(xì)胞，經(jīng)XGAL染色確定轉(zhuǎn)染效率；重組腺病毒ADLACZ、ADHIF1Α、ADHIF1Α、ADHIF1Α和ADHIF1Α體外轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞評(píng)價(jià)其生物安全性。第二部分取本院成人檢查骨髓正常結(jié)果的骨髓標(biāo)本。按PITTENGER的方法，分離骨髓標(biāo)本，取單個(gè)核細(xì)胞層培養(yǎng)、傳代。取第1、5、10代的貼壁細(xì)胞達(dá)到8090％融合后，流式細(xì)胞儀BECTONDICKINSONFACSCAN檢測(cè)FITCANTIHLADRCD13PE；FITCCD45CD34PE；FITCCD44CD29PE的表達(dá)。1ΜMOLL地塞米松、05MMOLLIBMX，10ΜGML胰島素的條件定向誘導(dǎo)HMSCS向脂肪細(xì)胞分化，第14D實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均行油紅O染色。01ΜMOLL地塞米松，10MMOLLΒ甘油磷酸，50ΜMOLLVITC條件定向誘導(dǎo)HMSCS向成骨細(xì)胞分化。第28DVONKOSSA’S染色及茜素紅染色顯示鈣鹽沉著。第三部分用終濃度為10ΜMOLL5AZA對(duì)第5代達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMSCS進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，作用24H，誘導(dǎo)后培養(yǎng)使用含5％胎牛血清DMEMLG培養(yǎng)基，每34D酌情換液。誘導(dǎo)培養(yǎng)第28D收獲細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)肌系細(xì)胞的標(biāo)記抗原及心肌特異性標(biāo)記抗原ΑACTIN、CONNEXIN43和心肌肌鈣蛋白TCARDIACTROPONINT，CTNT。第四部分ADLACZ感染HMSCS，經(jīng)XGAL染色確定轉(zhuǎn)染效率；重組腺病毒ADLACZ、ADHIF1Α、ADHIF1Α、ADHIF1Α和ADHIF1Α以最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染HMSCS后用5AZA對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)后的第14、28、32D，提取細(xì)胞漿蛋白行CTNI檢測(cè)。誘導(dǎo)的第28D提取細(xì)胞漿蛋白，用WESTERNBLOT方法檢測(cè)HIF1Α和VEGF蛋白表達(dá)水平。結(jié)果第一部分在HEK293細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增后的重組腺病毒ADLACZ、ADHIF1ΑADHIF1Α、ADHIF1Α和ADHIF1Α的滴度分別為19910PFUML、63110PFUML、39810PFUML、10010PFUML和12610PFUML；經(jīng)氯化銫梯度離心法純化后滴度分別為7755±047710OPUML、5077±018810OPUML、6848±012910OPUML、6292±026010OPUML和6193±022110OPUML；純化后病毒PCR檢測(cè)腺病毒骨架及所攜HIF1Α基因均得到預(yù)期的287BP、380BP、460BP和214BP擴(kuò)增產(chǎn)物，且DNA測(cè)序結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求；電鏡結(jié)果顯示腺病毒形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，無(wú)支原體、衣原體污染；轉(zhuǎn)染HEK293后XGAL染色顯示，最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)為50PFUCELL。第二部分㈠、HMSCS的分離、培養(yǎng)FICOLL分離液1077GML分離得到的單個(gè)核細(xì)胞24H后貼壁，細(xì)胞呈圓形，4872H后呈紡錘形、梭形、多角形，增殖迅速，原代培養(yǎng)約1420D可達(dá)到8090％融合。傳代細(xì)胞24H內(nèi)完全貼壁，57D內(nèi)達(dá)到8090％融合。并傳代至第710代。㈢、流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記物生長(zhǎng)良好的貼壁細(xì)胞在第1、5、10代時(shí)行表面標(biāo)記物檢測(cè)。第5代細(xì)胞均一性達(dá)到94％左右。CD34、CD45、HLADR陰性但CD13，CD29和CD44陽(yáng)性。㈢、定向誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞第3D起光鏡下可見脂滴沉著的細(xì)胞，外形變?yōu)閳A形，橢圓形，第14D油紅O染色示胞核呈藍(lán)色，脂滴呈橙紅色。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，脂肪細(xì)胞比例逐漸增高。對(duì)照組無(wú)脂滴出現(xiàn)。㈣、定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞細(xì)胞呈現(xiàn)立方形外觀。VONKOSSA’S染色及茜素紅染色均能顯示礦化物鈣鹽的沉積，而且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增高。對(duì)照組無(wú)礦化物鈣鹽的沉積。第三部分10ΜMOLL5AZA誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)變大，排列方向更趨一致，細(xì)胞增殖減慢，部分細(xì)胞脫壁死亡，23W可見少數(shù)細(xì)胞胞體粗大，呈長(zhǎng)方形。5AZA誘導(dǎo)培養(yǎng)28D的爬片細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)肌系細(xì)胞標(biāo)志，顯示部分誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)ΑACTIN，CONNEXIN43和CTNT，陽(yáng)性細(xì)胞率分別為3227±1317％、2951±522％和1996±401％。在未經(jīng)5AZA誘導(dǎo)的同培養(yǎng)天數(shù)的HMSCS中未見表達(dá)。第四部分隨著MOI值的升高，ADLACZ的轉(zhuǎn)染效率和基因表達(dá)增強(qiáng)，在MOI值為75OPUCELL時(shí)，ADLACZ轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的效率高于90％。誘導(dǎo)的第14、28、32D，ADLACZ、ADHIF1Α、ADHIF1Α、ADHIF1Α和ADHIF1Α四組均促進(jìn)HMSCS向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與對(duì)照ADLACZ組相比差異有顯著性P0000，ADHIF1Α、ADHIF1Α和ADHIF1Α三組CTNI值，與ADHIF1Α相比，亦有顯著性差異，P值分別為0001、0001以及0021。但是ADHIF1Α、ADHIF1Α和ADHIF1Α組間差異無(wú)顯著性，P值分別為0974、0229和0217。WESTERNBLOT結(jié)果顯示ADHIF1Α、ADHIF1Α、ADHIF1Α、ADHIF1Α四組HIF1Α蛋白表達(dá)水平較ADLACZ組高。VEGF蛋白表達(dá)也上升。結(jié)論第一部分本課題組構(gòu)建的重組腺病毒載體ADLACZ、ADHIF1Α、ADHIF1Α、ADHIF1Α和ADHIF1Α滴度高、轉(zhuǎn)染效率高且安全，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了保證。第二部分骨髓分離、培養(yǎng)HMSCS獲得成功，依據(jù)如下一、從骨髓分離、培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞樣外觀。二、高表達(dá)CD13、CD29和CD44CD34、CD45和HLADR表達(dá)極低。三、可以被定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。第三部分5AZA可以誘導(dǎo)純化培養(yǎng)的HMSCS向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，表達(dá)肌系蛋白及心肌特異性蛋白。含5％胎牛血清DMEMLG培養(yǎng)基適合于HMSCS向心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的體外實(shí)驗(yàn)研究。第四部分野生型HIF1Α基因及其突變型能促進(jìn)5AZA誘導(dǎo)的HMSCS向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，為HIF1Α進(jìn)一步應(yīng)用于心肌再生奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)分類號(hào)R6753學(xué)校代碼學(xué)校代碼10392學(xué)科專業(yè)代碼學(xué)科專業(yè)代碼100210學(xué)號(hào)號(hào)2121003552碩士學(xué)位學(xué)位論文論文抗病毒治療抗病毒治療在丙肝相關(guān)性肝癌根治術(shù)丙肝相關(guān)性肝癌根治術(shù)后的臨床臨床研究研究THECLINICALSTUDYOFANTIVIRALTREATMENTINHEPATITISCVIRUSRELATEDHEPATOCELLULARCARCINOMARECEIVINGRADICALRESECTIONS學(xué)位類型型臨床醫(yī)學(xué)碩士臨床醫(yī)學(xué)碩士所在學(xué)院院?？偢？偱R床臨床醫(yī)學(xué)院學(xué)院申請(qǐng)人姓名申請(qǐng)人姓名林折輝林折輝學(xué)科學(xué)科、專業(yè)專業(yè)外科學(xué)（普通外科）外科學(xué)（普通外科）導(dǎo)師師張紹庚張紹庚教授教授研究起止日期研究起止日期2012年12月至月至2015年5月答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)主席楊廣順楊廣順教授教授答辯日期期2015年5月18日二○一五○一五年五月目錄目錄附錄附錄1中文摘要中文摘要2英文摘要英文摘要4前言前言7研究對(duì)象與方法研究對(duì)象與方法91研究對(duì)象911診斷標(biāo)準(zhǔn)912納入標(biāo)準(zhǔn)913排除標(biāo)準(zhǔn)914肝硬化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)1015分組方法1016研究對(duì)象1217手術(shù)方法1218術(shù)后處置及治療152隨訪153統(tǒng)計(jì)方法15結(jié)果結(jié)果161兩組的臨床特征比較162兩組的圍手術(shù)期資料比較173兩組無(wú)瘤生存率及總生存率的對(duì)比17

簡(jiǎn)介：河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文巨細(xì)胞病毒激活感染的流行病學(xué)調(diào)查及與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者病例的對(duì)比研究姓名張鵬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師何俊瑛高玉林20070301中文摘要對(duì)河北省部分縣、市人群巨細(xì)胞病毒激活感染狀況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查人群中除外腦梗死、明顯免疫抑制者，作為對(duì)照組，共1167例檢測(cè)HCMVPP65，平均年齡5544_985歲，年齡與腦梗死組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中男性454例，女性713例。按照1995年全國(guó)第四屆腦血管病診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取2002年1月至2006年11月我院門診和住院患者臨床和影像學(xué)診斷為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死除外腔隙性腦梗死的病例為腦梗死組，共350例，其平均年齡59_1466歲，其中男性240例，女性110例。同時(shí)其中40例進(jìn)行了骨髓穿刺檢測(cè)HCMVPP65。應(yīng)用SAS612統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用F檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用T檢驗(yàn)，A等于005為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1對(duì)照組河北省部分地區(qū)人群抽血檢測(cè)巨細(xì)胞病毒晚期抗原PP65，共1167例，計(jì)算PP65陽(yáng)性率1988％。PP65陽(yáng)性率在男、女性別之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。PP65陽(yáng)性率在生活環(huán)境、職業(yè)或受教育程度上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，城鎮(zhèn)、文化工作者或受教育程度高者PP65陽(yáng)性率較低，見表2。PP65陽(yáng)性率在地區(qū)間有顯著差異，滄州地區(qū)最高3673％，保定地區(qū)次之2714％，石家莊地區(qū)最低1239％，見表3和圖3。PP65陽(yáng)性率在各年齡段間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是隨年齡升高，有上升趨勢(shì)，見表4和圖4。2腦梗死組動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者共350例，抽血檢測(cè)巨細(xì)胞病毒晚期抗原PP65，其陽(yáng)性率3571％。腦梗死組中PP65陽(yáng)性率在男、女性別之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表5。同時(shí)其中40例進(jìn)行了骨髓穿刺檢測(cè)HCMVPP65，計(jì)算PP65陽(yáng)性率5714％，與相應(yīng)的靜脈血PP65陽(yáng)性率4048％比

簡(jiǎn)介：POKEMON分子在人類腫瘤如T、B細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和膀胱癌等疾病的腫瘤中異常高表達(dá)，被直接證明是腫瘤發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素。POK蛋白家族成員在胚胎發(fā)育分化和致瘤中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。POKEMONPOK細(xì)胞髓樣發(fā)生因子，亦稱為L(zhǎng)RFOCZF和FBI1是POK蛋白家族成員，由ZBTB7基因編碼，在細(xì)胞分化中作用居多并且自身能夠影響其它的POK家族成員。缺失ZBTB7基因的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞對(duì)其它原癌基因如E1A、RAS、MYC和TAG等介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化完全無(wú)反應(yīng)；在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中POKEMON的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，并且證明了它是通過(guò)直接結(jié)合而特異地抑制腫瘤抑制基因ARF的轉(zhuǎn)錄。POKEMON基因的作用模式為POKEMON↑↑→ARF↓→MDM2→P53↓→腫瘤發(fā)生。因此，以POKEMON基因?yàn)榘袠?biāo)的腫瘤基因治療具有十分重要的意義。為解決靶向沉默POKEMON基因來(lái)治療腫瘤的問(wèn)題，我們借鑒了近幾年來(lái)出現(xiàn)的有關(guān)RNA干擾RNAINTERFERENCE，RNAI的實(shí)驗(yàn)研究。RNAI是出現(xiàn)在多種生物體內(nèi)、進(jìn)化上高度保守的一種基因保護(hù)機(jī)制，被稱為“基因組的免疫系統(tǒng)”。其基本作用途徑為長(zhǎng)DSRNA被具有RNASEⅢ活性的DICER復(fù)合體切割成2123BP的小雙鏈RNA或稱為小干擾RNASMALLINTERFERINGRNA，SIRNA，SIRNA的負(fù)鏈與其它多種成分組成RISCRNAINDUCEDSILENCINGCOMPLEX，最后通過(guò)堿基配對(duì)的方式觸發(fā)同源MRNA的特異性降解。現(xiàn)在，SIRNA已經(jīng)成為應(yīng)用于臨床疾病防治研究的有力工具。已經(jīng)證實(shí)，SIRNA對(duì)HBV、HIV等病毒和前列腺癌、白血病等腫瘤細(xì)胞基因都有很好的沉默作用。這些都為本課題研究將RNAI應(yīng)用到腫瘤的基因治療領(lǐng)域提供了理論依據(jù)?；诖?，本研究利用RNAI技術(shù)對(duì)POKEMON基因表達(dá)進(jìn)行抑制以達(dá)到治療腫瘤的目的，進(jìn)行了以下研究1、針對(duì)POKEMON基因的SIRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定1設(shè)計(jì)針對(duì)POKEMON基因的靶序列利用美國(guó)著名RNA產(chǎn)品公司AMBION提供的網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)工具，記錄每個(gè)AA的3端19個(gè)氨基酸作為潛在SIRNA靶位點(diǎn)。潛在靶位點(diǎn)通過(guò)BLAST分析，去除同源性的靶序列，選擇GC含量在4055％的靶位點(diǎn)序列，按在F中平均分布的原則，選取4個(gè)SIRNA靶標(biāo)。2構(gòu)建并鑒定POKEMON基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒將設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸鏈克隆入PSILENCER51H1RETRO載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ECOLI。制備的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定證明重組成功。2、質(zhì)粒介導(dǎo)型SIRNA體外抑制POKEMON基因表達(dá)的研究1選取4種細(xì)胞HELA、COS7、293和JURKAT，用RTPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中POKEMON基因的表達(dá)。2將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入表達(dá)POKEMON基因的體外培養(yǎng)的HELA細(xì)胞和不表達(dá)POKEMON基因的293細(xì)胞首先確定最佳細(xì)胞接種密度和嘌呤霉素的最適篩選濃度，然后，按照AMBION公司SIPTTM技術(shù)將4組重組質(zhì)粒和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒H1CYCLO、陰性對(duì)照質(zhì)粒H1SCR轉(zhuǎn)染入HELA細(xì)胞和293細(xì)胞。3鑒定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的體外基因沉默效果繼續(xù)嘌呤霉素篩選擴(kuò)大培養(yǎng)，將存活細(xì)胞做RTPCR鑒定基因沉默效果。3、POKEMON基因的SIRNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備及感染效果評(píng)價(jià)1DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)PT67包裝細(xì)胞2按照AMBION公司的SIRNATMPT轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書及BD公司PT67包裝細(xì)胞使用說(shuō)明轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的逆轉(zhuǎn)錄病毒制備細(xì)胞系3接種NIH3T3細(xì)胞，用PT67產(chǎn)生的病毒上清感染細(xì)胞，測(cè)定病毒滴度并收集貯存病毒。4取已感染病毒的HELA細(xì)胞和未感染的HELA細(xì)胞做軟瓊脂培養(yǎng)，集落計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析鑒定體外基因沉默效果。結(jié)果顯示，我們?cè)O(shè)計(jì)合成的4對(duì)SIRNAS模板DNA片段連接到PSILENCER51H1RETRO載體后，經(jīng)過(guò)抗生素抗性篩選、雙酶切和測(cè)序鑒定，顯示我們已經(jīng)成功地克隆了這些DNA片段。通過(guò)RTPCR方法，我們鑒定了HELA細(xì)胞系高表達(dá)POKEMON基因，而COS7、293和JURKAT細(xì)胞中未見明顯的表達(dá)。將上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)POKEMON基因的HELA細(xì)胞和不表達(dá)POKEMON基因的對(duì)照293細(xì)胞后，結(jié)果顯示HELA細(xì)胞中的POKEMON基因表達(dá)顯著受到抑制，其中重組質(zhì)粒H1HP2的效果最好。在集落形成實(shí)驗(yàn)中，用H1HP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后所制備的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的集落抑制效果最好。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為H1HP2病毒下一步的體內(nèi)POKEMON基因沉默實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多妊娠期人微小病毒B19感染的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腸道病毒71型感染中的作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf精彩內(nèi)容。