基于LCM技術的人子宮內膜癌相關基因的篩選、克隆與鑒定.pdf

1、第一部分激光捕獲纖維切割與微量RNA的提取、純化、濃縮 目的：摸索一條可行的技術路線，運用激光捕獲顯微切割(LCM)技術獲取無間質混雜的人正常子宮內膜腺管上皮細胞與子宮內膜癌細胞，用于進行子宮內膜癌相關基因差異表達的研究。 方法：采用LCM技術分別從正常子宮內膜組織及子宮內膜癌組織冰凍切片中捕獲子宮內膜腺管上皮細胞及子宮內膜癌細胞，提取微量RNA，并對微量RNA進行純化及濃縮。設立對照實驗鑒定微量RNA的完整性，分光光度

2、計檢測RNA的濃度。 結果：分別從冰凍切片中捕獲子宮內膜腺管上皮細胞280，000shootings，捕獲子宮內膜癌細胞196，000shootings。對照實驗Ⅰ、Ⅱ證實經(jīng)LCM后RNA完整性較好。確定了LCMshooting次數(shù)與可獲得RNA量間對應關系。 結論：通過LCM技術可以從冰凍切片中捕獲單一類型的目的細胞，此過程不會造成細胞RNA明顯降解，可以應用于下游的實驗研究。 第二部分人子宮內膜癌相關基因cD

3、NA片段的篩選、克隆與鑒定 目的：篩選、克隆與鑒定人子宮內膜癌發(fā)病相關基因片段，探索子宮內膜癌發(fā)生的分子機制。 方法：采用熒光差異顯示技術(FDD-PCR)比較LCM捕獲細胞提取的正常子宮內膜腺管細胞RNA與子宮內膜癌細胞RNA，篩選與子宮內膜癌發(fā)病特異相關的差異基因片段，克隆測序后反向Northern點雜交(使用擴增的RNA)驗證差異片段的真假，對陽性片段利用Genebank進行BLAST比對分析。 結果：共獲

4、得38條差異條帶，3條在正常子宮內膜中高表達，35條在子宮內膜癌中高表達。對10條再回收差異條帶進行克隆并測序，經(jīng)反向Northern點雜交鑒定獲得6條陽性差異基因片段。經(jīng)BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)：L1.1與細胞周期蛋白依賴性激酶7(CDK7)同源性為99％；L1.9與人類蛋白磷酸酶1調節(jié)抑制亞單位12A(PPP1R12A)同源性為99％；L1.21和L1.22與E1A激活基因1的抑制子(CERG)同源性為100％；L1.25、L1.26

5、與鋅轉運家族中的10號鋅轉運體(SLC39A10)同源性為98％以上。 結論：通過LCM技術與FDD-PCR技術的結合，獲得了與子宮內膜癌發(fā)病特異相關的基因片段。首次從基因水平發(fā)現(xiàn)了CDK7、PPP1R12A、CERG、SLC39A10與子宮內膜癌發(fā)病的相關性，補充了對子宮內膜癌發(fā)病的分子機理的認識。其中CDK7、CERG、SLC39A10可以作為新的子宮內膜癌候選癌基因，PPP1R12A可以作為新的子宮內膜癌候選抑癌基因來進行

6、進一步更深層次的研究。 第三部分CDK7蛋白表達與人子宮內膜癌臨床特點的相關性研究 目的：研究CDK7在子宮內膜癌組織中的蛋白表達情況及與子宮內膜癌臨床特點的關系。 方法：采用免疫組化染色技術檢測CDK7在47例子宮內膜癌組織中的表達情況，以10例正常子宮內膜組織為對照研究并進行統(tǒng)計學分析。 結果：CDK7在子宮內膜癌中的表達率(74.5％)明顯高于其在正常子宮內膜中的表達率(10.0％)(P＜0.05)