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簡(jiǎn)介：山東大學(xué)博士學(xué)位論文人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子（HTERTPROMOTER）介導(dǎo)的ODC、SAMDC反義腺病毒的構(gòu)建及其靶向抗腫瘤研究姓名王偉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師劉賢錫20091025山東大學(xué)博學(xué)位論文基因啟動(dòng)子更是備受關(guān)注【14】。體外轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中分別采用HTERT啟動(dòng)子與CMV啟動(dòng)子來(lái)轉(zhuǎn)染不同的腫瘤細(xì)胞系，包括人肺癌細(xì)胞系CHL299和A549，結(jié)腸癌細(xì)胞系DLDL和LOVO，人宮頸癌細(xì)胞HELA及兩種正常細(xì)胞系，結(jié)果顯示對(duì)于腫瘤細(xì)胞，HTERT啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率較CMV高23倍；而就正常細(xì)胞來(lái)說(shuō)，CMV轉(zhuǎn)基因的表達(dá)比HTERT高500多倍，這充分展示了HTERT啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的高效性與特異性。此后進(jìn)行的體內(nèi)直接轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。據(jù)此，本課題擬將ODC、SAMDC的反義基因分別構(gòu)建入PADEASYL系統(tǒng)，由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子HTERTP啟動(dòng)表達(dá)，檢測(cè)重組病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異抑制作用，為腫瘤疾病的靶向性基因治療奠定基礎(chǔ)。第一部分細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)及外源HTERT啟動(dòng)子活性檢測(cè)2【研究目的】檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)中擬使用的五株細(xì)胞中端粒酶的活性，并檢測(cè)端粒酶催化亞基啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系中的啟動(dòng)活性，為下一步人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子啟動(dòng)的ODC、SAMDC反義病毒載體的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。【研究方法】1體外穩(wěn)定培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞系人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人肝癌細(xì)胞系BEL7402、HEPG2及正常細(xì)胞系人胚肺成纖維細(xì)胞HELF、人肝細(xì)胞L02。2提取各株細(xì)胞端粒酶蛋白，利用TRAP法進(jìn)行端粒酶活性的檢測(cè)，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。即將101DTRAP產(chǎn)物與含溴酚藍(lán)的6凝膠載樣緩沖液2山混合，在120V的電壓下，進(jìn)行12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，直至電流使溴酚藍(lán)色帶泳出凝膠為止。固定銀染顯色后，出現(xiàn)4條以上間隔6BPL拘梯度條帶者為端粒酶活性陽(yáng)性。3將帶有由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子HTERTP啟動(dòng)的指示基因LUE

簡(jiǎn)介：研究目的手足口病HFOOTMOUTHDISEASE，HFMD是一種兒童常見(jiàn)的腸道病毒傳染病，主要由腸道病毒71型ENTEROVIRUSTYPE71，EV71和柯薩奇病毒A組16型COXSACKIEVIRUSA16，CVA16引起。近年來(lái)，許多國(guó)家和地區(qū)發(fā)生多次大規(guī)模的HFMD疫情暴發(fā)流行，我國(guó)HFMD發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年大幅上升的趨勢(shì)，其中EV71型HFMD重癥和死亡病例更是明顯增多，對(duì)嬰幼兒的健康甚至生命構(gòu)成重大威脅，給家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而EV71感染尚無(wú)特效的治療藥物。因此，盡早研制出安全有效的疫苗，對(duì)EV71型HFMD疫情的防控具有重要的意義。近幾年，EV71疫苗研發(fā)進(jìn)展迅速，我國(guó)3家疫苗公司研制的EV71滅活疫苗均已完成Ⅲ期臨床觀察，進(jìn)入臨床審評(píng)階段。根據(jù)世界衛(wèi)生組織及國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的相關(guān)規(guī)定，新疫苗在申請(qǐng)生產(chǎn)批件之前，需開(kāi)展批間一致性臨床研究，以驗(yàn)證疫苗生產(chǎn)過(guò)程的一致性。本研究基于北京微谷生物醫(yī)藥有限公司研制的EV71滅活疫苗Ⅲ期臨床試驗(yàn)，研究目的是考核連續(xù)三批EV71滅活疫苗的免疫原性與安全性。研究方法1研究對(duì)象EV71滅活疫苗Ⅲ期臨床試驗(yàn)中的所有受試者。2研究設(shè)計(jì)EV71滅活疫苗Ⅲ期臨床試驗(yàn)采用了多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰荊對(duì)照的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以知情同意、自愿參加為原則，受試者按照1∶1∶1∶3的比例隨機(jī)分配到三批次試驗(yàn)疫苗組或安慰劑對(duì)照組，按照0、28天的免疫程序進(jìn)行兩劑肌肉注射。連續(xù)三批次試驗(yàn)疫苗的規(guī)格為320U05ML（含鋁佐劑），安慰劑對(duì)照的規(guī)格為0U05ML（含鋁佐劑）。免疫原性評(píng)價(jià)受試者在第0天和第56天分別采集3ML血清樣本，對(duì)采集到的血清樣本進(jìn)行抗EV71中和抗體（NEUTRALIZINGANTIBODY，NTAB）檢測(cè)。安全性評(píng)價(jià)所有受試者監(jiān)護(hù)人在日記卡上自行記錄每針次疫苗接種后第07天發(fā)生的征集性癥狀體征以及第028天發(fā)生的非征集性癥狀體征。3統(tǒng)計(jì)方法使用SPSS180和STATASE120統(tǒng)汁分析軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P≤005作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。定量資料中服從正態(tài)分布的采用參數(shù)檢驗(yàn)不符合正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗(yàn)。定性資料一般采用X2檢驗(yàn)或FISHER檢驗(yàn)。免疫原性批間一致性評(píng)價(jià)等效區(qū)間預(yù)設(shè)為067，15。研究結(jié)果1總體情況共招募12385名635月齡健康志愿者，2140名志愿者入組前被排除，10245名受試者隨機(jī)分配到三批次試驗(yàn)疫苗組或安慰劑對(duì)照組。其中，70名受試者免前采血脫落，剩余7263名受試者免前抗體陰性，2912名受試者免前抗體陽(yáng)性。2免疫原性評(píng)價(jià)結(jié)果全程免疫后，全人群批次1、2、3的幾何平均滴度GEOMETRICMEANTITER，GMT依次為70655UML、79346UML和87009UML，三批次疫苗組間GMT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0002免前陰性組批次1、2、3的GMT依次為40704UML、46811UML和52061UML，三批次疫苗組間GMT值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0001免前陽(yáng)性組批次1、2、3的GMT依次為270403UML、319199UML和292544UML，三批次疫苗組間GMT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0262。無(wú)論全人群、免前陰性人群還是免前陽(yáng)性人群，三批次疫苗組間兩兩比較的GMT比值及其95％可信區(qū)間均落在預(yù)先設(shè)定的等效區(qū)間067，15范圍內(nèi)。3安全性評(píng)價(jià)結(jié)果三批次試驗(yàn)疫苗組間總體不良反應(yīng)ADVERSEREACTION，AR不良事件ADVERSEEVENT，AE、征集性AR和非征集性AE的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)論研究結(jié)果表明連續(xù)三批EV71滅活疫苗（VERO細(xì)胞）在中國(guó)635月齡兒童中具有良好的免疫原性和可接受的安全性。

簡(jiǎn)介：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院博士后學(xué)位論文腦電非線性分析在認(rèn)知功能研究和麻醉深度監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用姓名吳東宇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士后專(zhuān)業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師朱克尹嶺20050401博士艨研究工作報(bào)告腦電非線性分析在認(rèn)知功能耕究和麻醉深度般測(cè)中的應(yīng)用薷2頁(yè)前言腦電圖ABEG魁一種無(wú)創(chuàng)，價(jià)格低廉，方便有效并廣為臨床上使用的檢查手段。腦電是大腦神經(jīng)元興奮餓和抑制性突觸后電位的總體反殃，大腦掰有高級(jí)耱綴功髓活動(dòng)豹信惠都湮浚予虢毫這個(gè)“淀洋大?！敝?。作蠢～靜蠢接了解大腦功能狀態(tài)的手段，它為我們打開(kāi)了一扇深入研究大腦功能活動(dòng)的窗戶(hù)。近年來(lái)，非線性科學(xué)成為嬲今辯學(xué)界最活躍的學(xué)科之～。目前，它已成功運(yùn)愆翻生鑫囂學(xué)豹誨多學(xué)秘當(dāng)審，包搖，玉藏瘺學(xué)、穆經(jīng)瘓學(xué)、薅糖薅掌等，浚及生物醫(yī)學(xué)工程包括生物力學(xué)、生物材料、駐療儀器、醫(yī)學(xué)成像技術(shù)及壤復(fù)工程等。利用混沌與分形理論等非線性動(dòng)力學(xué)原理和方法來(lái)研究和分析火腦的功能活渤狀態(tài)，己綴成為大腦功然研究豹薪熱點(diǎn)。鑄統(tǒng)腦電窩分耩手段羥納麓來(lái)可分為兩犬類(lèi)時(shí)域疆IME踟髓IN分耩幫頻域FREQUENCYDOILIAIN分析。時(shí)域分析表現(xiàn)腑電信號(hào)數(shù)據(jù)隨時(shí)間變化的規(guī)律和所反映的信息，包括波幅、頻率、時(shí)程，孵態(tài)分布和曲線下面積等，童要反映瑟彀蕊號(hào)戇囂秀羧覆。簇蠛分輯表瑗疆毫蕊芍?jǐn)?shù)據(jù)蕤蘩率交純懿麓鋒秘茨愛(ài)浹的信息，其核心為基于快速傅立葉交換的備頻段功率譜估計(jì)，包括功率譜、相干替。傅立葉黛換要求信號(hào)鼴確定的并且甲穩(wěn)的，而腦電信號(hào)中存程著許多突發(fā)靜、瓣態(tài)豹俊號(hào)如耱波甕，這轉(zhuǎn)情況下譜分撰反致較差。近年來(lái)，小波分櫥、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分拼和菲線往渤力學(xué)分拆等群始運(yùn)用于腦亳信號(hào)的分析，它們代表了腦電信號(hào)分析方法的未來(lái)發(fā)展方向。根據(jù)神經(jīng)生理學(xué)腦電的產(chǎn)黛機(jī)制，按照現(xiàn)有研究成果的理解，很明盥EEG穰號(hào)起源手一令巍發(fā)匏龔線縫系統(tǒng)。不僅襲審樞耱經(jīng)系綾繇令分瀑痿次避經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多的反饋環(huán)路，而且單個(gè)神經(jīng)元自身也襲現(xiàn)出高度的非線性因素，現(xiàn)代科學(xué)研究表明，神綴細(xì)胞膜上可以觀察到混沌行為；神經(jīng)放電節(jié)律轉(zhuǎn)化遵循分叉援德；囂混漣和分叉均矮子菲線健穆學(xué)夔范疇。巒魏習(xí)霓，囂囂中怠食了大量菲線髓單元結(jié)禱活動(dòng)的信息。出巨量神經(jīng)霓及其突觸形成的神經(jīng)勰絡(luò)黨全有可能使腦電信號(hào)表現(xiàn)出混沌特性。隨著系統(tǒng)論和非線性動(dòng)力學(xué)理論的發(fā)展，現(xiàn)代科學(xué)試為腦電信號(hào)是大量神綴細(xì)胞的非線性耦合，是～個(gè)高度非線性的多單元連接靜復(fù)合髂；蒎窀活動(dòng)其纛確定往混淹玲ETER瑤INISTIE曲80S，酌特毪；久類(lèi)大腦是一個(gè)復(fù)雜的、自組織SELFORGANIZATION的非線性動(dòng)力學(xué)系統(tǒng)，非線性動(dòng)力學(xué)分析方法也因此更廣泛地應(yīng)用于對(duì)犬腦功能的基礎(chǔ)和臨床研究，它可激提供線性分輯不麓獲霉豹、蠢關(guān)享孛經(jīng)囂終殛能戇莛惠。在眾多菲線憔現(xiàn)象中，混沌運(yùn)動(dòng)顯得允為突出。混沌壤論是一門(mén)研究非線性系統(tǒng)的新型學(xué)科，它的基本觀點(diǎn)是簡(jiǎn)單確定的非線性系統(tǒng)可以產(chǎn)生簡(jiǎn)單確

簡(jiǎn)介：第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子151重組腺病毒聯(lián)合地塞米松防治角膜移植排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究姓名劉銀平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)眼科學(xué)指導(dǎo)教師柳林20050401血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子151重組腺病毒聯(lián)合地塞米松防治角膜移植排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究摘要目的研究血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子151重組腺病毒ADVEGI。聯(lián)合地塞米松防治異種板層角膜移植排斥反應(yīng)的可行性。方法利用腺病毒載體構(gòu)建攜帶VEGLLSL基因的質(zhì)粒，經(jīng)293A細(xì)胞包裝、擴(kuò)增；縫線誘導(dǎo)法建立炎癥性兔角膜新生血管模型，給予體內(nèi)基因治療建立異種板層角膜移植動(dòng)物模型，將ADVEGLL5I與地塞米松聯(lián)合應(yīng)用觀察ADVE61151與地塞米松聯(lián)合應(yīng)用對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)的防治作用。結(jié)果ADVEGI。，L在病變細(xì)胞內(nèi)能成功表達(dá)有效蛋白，可以強(qiáng)烈抑制靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)；對(duì)炎癥性角膜新生血管的生長(zhǎng)具有抑制作用；ADVEGIT51和地塞米松聯(lián)合應(yīng)用與單獨(dú)用藥相比可明顯抑制角膜移植術(shù)后新生血管的生長(zhǎng)，減少排斥反應(yīng)發(fā)生機(jī)率。結(jié)論ADVEGLL5L對(duì)角膜新生血管的形成具有抑制作用；其與地塞米松局部聯(lián)合應(yīng)用可減少角膜移植術(shù)后新生血管形成，從而降低異種板層角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)生率。關(guān)鍵詞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子；基因泊療；重組腺病毒；角膜新生血管地塞米松異種角膜板層移植THESTUDYOFVASCULARENDOTHELIALGROWTHINHIBITOR151RECOMBINANTADENOVIRUSESCOMBINEDWITHDEXAMETHASONESUPPRESSINGHETEROLAMELLARCORNEALTRANSPLANTATIONREJECTIONABSTRACT0BJECTIVETOEVALUATETHEPROBABILITYOFVASCULARENDOTHELIALGROWTHIT】HIBITOR151VEGLL51RECOMBINANTADENOVIRUSESCOMBINEDWITHDEXAMETHASONEOILSUPPRESSINGHETEROLAMELLARCORNEALTRANSPLANTATIONREJECTIONMETHODSVEGLL51GENEWASCLONEDINTOADENOVIRUSVECTORANDTHENPACKEDIN293ACELLTOMAKE

簡(jiǎn)介：背景HBV感染是我國(guó)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。HBV感染就臨床表現(xiàn)而言形式多樣可出現(xiàn)急性肝炎、慢性肝炎、肝臟纖維化、肝硬化及肝細(xì)胞癌等。部分感染患者可在慢性肝炎基礎(chǔ)上出現(xiàn)急性發(fā)作導(dǎo)致肝功能衰竭即慢加急性肝衰竭ACUTEONCHRONICLIVERFAILUREACLF死亡率高。作為機(jī)體清除或控制肝細(xì)胞內(nèi)HBV感染的重要免疫細(xì)胞HBV抗原表位特異性CTL它可識(shí)別HBV蛋白中的CTL表位EPITOPE進(jìn)而發(fā)揮其免疫作用。本研究在對(duì)不同基因型的急性乙型肝炎ACUTEHEPATITISBAHB、慢性乙型肝炎CHRONICHEPATITISBCHB和ACLF患者的HBVHLAA2限制性特異性CTL表位變異分析的基礎(chǔ)上針對(duì)與疾病進(jìn)展相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變異表位進(jìn)行體外HLAA2分子親和力鑒定并對(duì)HBV包膜蛋白ENVELOPPROTEIN上的HLAA2限制性表位ENV183191野生變異多肽在HLAA2轉(zhuǎn)基因C57小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出的CTL細(xì)胞對(duì)野生表位的識(shí)別和體外殺傷能力進(jìn)行研究為進(jìn)一步分析研究HBV感染患者重癥化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。目的1在獲得的不同診斷的乙型肝炎患者來(lái)源的HBV全長(zhǎng)序列對(duì)比分析其已鑒定的HBVHLAA2限制性表位的變異形式和變異后親和力的變化確定與疾病進(jìn)程相關(guān)的表位變異類(lèi)型。2由于HLAA2限制性表位ENV183191表位變異率在AHB和ACLF中較高而CHB中較低推測(cè)可能與宿主炎癥反應(yīng)有關(guān)因此選擇其作為研究對(duì)象明確其野生表位和變異表位在HLAA2轉(zhuǎn)基因C57小鼠中的特異性CTL免疫識(shí)別和殺傷效應(yīng)。方法1“兩片段”法PCR擴(kuò)增獲得不同診斷的乙型肝炎患者血清HBV全長(zhǎng)序列516條對(duì)來(lái)源于HLAA2陽(yáng)性患者的C基因型HBV全長(zhǎng)序列分析發(fā)現(xiàn)有12個(gè)表位的變異與乙肝疾病進(jìn)程相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)已發(fā)現(xiàn)的12個(gè)存在變異的表位在BIMAS網(wǎng)站進(jìn)行親和力預(yù)測(cè)隨后采用人抗原呈遞相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷型淋巴細(xì)胞系T2對(duì)ENV183191野生變異表位進(jìn)行體外親和力實(shí)驗(yàn)。2挑選HLAA2限制性表位ENV183191野生型WTFLLTRILTI和其對(duì)應(yīng)變異表位SFSLTRILTIKFLLTKILTISKFSLTKILTI構(gòu)建HBVENV蛋白PCDNA31真核表達(dá)載體免疫HLAA2轉(zhuǎn)基因C57小鼠同時(shí)用相應(yīng)的表位多肽加強(qiáng)免疫5周后取小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行ELISOPT、HLAA2五聚體PENTAMER和體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。結(jié)果1BIMAS親和力預(yù)測(cè)顯示有10個(gè)表位變異后與HLAA2分子的親和力減弱2個(gè)表位變異后親和力增強(qiáng)。T2細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)ENV183191野生型和變異型表位親和力結(jié)果與BIMAS預(yù)測(cè)結(jié)果一致。2ENV183191野生變異表位免疫小鼠后ELISOPT實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)T有較強(qiáng)的IFNΓ分泌能力KS和SK能力較弱。PENTAMER細(xì)胞染色流式分析后顯示K變異表位疫苗免疫小鼠對(duì)野生表位CTL有交叉反應(yīng)但對(duì)S變異表位無(wú)交叉反應(yīng)S變異表位疫苗免疫小鼠對(duì)野生表位CTL有交叉反應(yīng)但對(duì)K變異表位無(wú)交叉反應(yīng)。SK變異表位疫苗免疫小鼠對(duì)野生表位和S變異表位有交叉反應(yīng)但對(duì)K變異表位無(wú)交叉反應(yīng)野生表位疫苗免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生較弱的針對(duì)K與S變異表位的交叉反應(yīng)。殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ELISPOT結(jié)果一致。WT免疫小鼠中特異性CTL的殺傷結(jié)果要明顯高于其他變異型表位多肽免疫小鼠中的。結(jié)果顯示變異型表位可誘導(dǎo)較野生型表位弱的CTL反應(yīng)該CTL反應(yīng)不能有效地清除HBV。結(jié)論HBV基因變異可引起CTL表位變異且與HBV感染疾病進(jìn)展相關(guān)。大多數(shù)表位變異后親和力降低。其中ENV183191表位變異可影響CTL對(duì)病毒的結(jié)合能力變異型表位較野生型表位誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)弱。因此認(rèn)為該CTL反應(yīng)不能有效清除HBV而導(dǎo)致肝細(xì)胞產(chǎn)生持續(xù)炎癥反應(yīng)可能是影響機(jī)體對(duì)HBV特異性免疫應(yīng)答的機(jī)制之一。

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簡(jiǎn)介：復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文溶瘤腺病毒介導(dǎo)抑癌基因HCCS1治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究；抗膜聯(lián)蛋白Ⅰ單克隆抗體的制備與鑒定姓名蔡幸申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)腫瘤免疫學(xué)指導(dǎo)教師趙新泰20060401復(fù)日大學(xué)頌十研究生學(xué)位論文第一部分溶瘤腺病毒介導(dǎo)抑癌基因ICCSL治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究摘要目的用腫瘤特異性增殖腺病毒ZD55把抑癌基因HCCSL靶向性導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZD55聯(lián)合HCCSL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，探索新的基因病毒治療腫瘤的方法。方法首先將HCCSL基因克隆于質(zhì)粒載體PCAL3中，構(gòu)建亞克隆PCAL3HCCSL，用BGLII酶切質(zhì)粒PCAL3HCCSL，切出包含CMV啟動(dòng)子、HCCSL基因及SV40POLYA的HCCSL表達(dá)框。把該表達(dá)框裝入腺病毒穿梭載體PZD55，得到克隆PZD55HCCSL，將其與腺病毒包裝質(zhì)粒PBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組，得到基因病毒ZD55一HCCSI。病毒經(jīng)過(guò)3次空斑純化，通過(guò)PCR、RTPCR和WESTERNBLOT鑒定病毒的正確性。ZD55一HCCSL在293細(xì)胞中大量擴(kuò)增，并通過(guò)CSCL梯度離心純化病毒，測(cè)定純化病毒的滴度。用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒感染后腫瘤細(xì)胞的存活率，荷瘤動(dòng)物治療試驗(yàn)檢測(cè)病毒對(duì)腫瘤的治療作用。結(jié)果獲得了只能在腫瘤細(xì)胞中增殖復(fù)制、而在正常細(xì)胞中不能復(fù)制，并且在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)HCCSL蛋白的基因病毒ZD55一HCCSL。結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該病毒具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。MTT實(shí)驗(yàn)顯示其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯強(qiáng)于ONYX015；與ONYX015相似，對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用。在荷人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的裸鼠模型中，基因病毒ZD55一HCCSL能顯著抑止腫瘤的生長(zhǎng)，甚至可以完全殺滅腫瘤細(xì)胞，抑瘤率達(dá)到97％以上，獲得了很好的治療效果。結(jié)論本研究成功利用缺失E1B一55KDA基因的腺病毒載體攜帶外源治療基因HCCSL，構(gòu)建了一個(gè)在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖和表達(dá)HCCSL的腺病毒ZD55HCCSL，并且在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都取得了很好的抗腫瘤效果，為腫瘤的基因病毒治療提供了新內(nèi)容。關(guān)鍵詞腫瘤特異性增殖腺病毒；ZD55；HCCSL基因；靶向腫瘤基因一病毒治療中圖分類(lèi)號(hào)R3

簡(jiǎn)介：揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文腦微出血危險(xiǎn)因素及與認(rèn)知功能障礙關(guān)系姓名陳峰申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師陸建明20100501陳峰腦微出血危險(xiǎn)因素及與認(rèn)知功能障礙的關(guān)系5腦微出血在有卒中史病人中有較高的發(fā)生率，并且與高血壓、腔隙性腦梗死、腦白質(zhì)疏松、高齡、抗栓藥物的使用等密切相關(guān)。CMBS存在與數(shù)目與認(rèn)知功能下降明顯相關(guān)，是血管性認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。CMBS可以被視作是導(dǎo)致認(rèn)知障礙的潛在小血管病變的生物學(xué)標(biāo)志。MOCA對(duì)輕度血管性認(rèn)知障礙的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于MMSE，有利于VCI的早期診斷和血管性癡呆ⅣD的防治。對(duì)腦微出血的充分認(rèn)識(shí)有利于判斷有患者無(wú)腦小血管病變及病變程度，臨床上應(yīng)該對(duì)可能有輕度認(rèn)知功能障礙的患者予MOCA量表評(píng)估并結(jié)合頭顱MRG1迮序列以檢測(cè)CMBS，判斷有無(wú)腦小血管病變，預(yù)防向血管性癡呆發(fā)展，改善預(yù)后。

簡(jiǎn)介：本研究中將HGF基因通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSC，對(duì)MSC進(jìn)行修飾，利用MSC歸巢效應(yīng)定位于移植肝，長(zhǎng)期分泌HGF，形成一個(gè)免疫抑制的微環(huán)境，增強(qiáng)MSC的免疫抑制功能，發(fā)揮HGF調(diào)節(jié)免疫和組織修復(fù)的功能，取得協(xié)同效應(yīng)，減輕排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間，為肝移植急性排斥提供新的治療策略。第一部分改良式大鼠同種異體原位肝移植模型的建立目的探討改良“二袖套法”原位大鼠肝移植模型的建立。方法SD大鼠為供、受體的同基因肝移植70只SDSD組，SD、WISTAR分別為供、受體的同種異體肝移植60只SDWISTAR組。采用改良的“二袖套法”進(jìn)行大鼠原位肝移植，充分暴露第一肝門(mén)，不翻動(dòng)肝臟先行門(mén)靜脈灌注。在體一步法離斷肝上下腔靜脈，不帶膈肌環(huán)。吻合肝上下腔靜脈采用單線連續(xù)縫合；雙線牽引法安裝門(mén)靜脈袖套。術(shù)后充分補(bǔ)液維持大鼠血液動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定。結(jié)果供體手術(shù)時(shí)間382±25MIN，受體手術(shù)時(shí)間456±35MIN，無(wú)肝期151±22MIN，手術(shù)成功率93％，1周存活率92％，與傳統(tǒng)二袖套法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005。SDSD組手術(shù)成功64只，受體長(zhǎng)期存活，術(shù)后肝功能很快恢復(fù)正常，肝組織病理無(wú)明顯變化。SDWISTAR組手術(shù)成功57只，受體存活時(shí)間820D，平均105D。大鼠于術(shù)后35D出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，未經(jīng)處理后均死亡。結(jié)論改良式大鼠原位肝移植操作簡(jiǎn)便、成功率高、易于復(fù)制，是肝移植實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。SDWISTAR大鼠組合是一組高排斥的肝移植模型，可發(fā)生典型的急性免疫排斥反應(yīng)。第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定及在移植肝內(nèi)定居能力的觀察目的體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠骨髓間充質(zhì)于細(xì)胞MSC，并進(jìn)行鑒定，觀察其在肝移植受體內(nèi)的定居能力。方法利用直接貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠MSC，并傳代擴(kuò)增，相差顯微鏡下觀察生長(zhǎng)特性。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志。定向誘導(dǎo)MSC向成骨和成脂肪分化，鑒定其多向分化潛能。DAPI熒光標(biāo)記MSC，由門(mén)靜脈注入同種異體肝移植后受體內(nèi)，取肝組織冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察其在移植肝內(nèi)的定居情況。結(jié)果直接貼壁法成功分離培養(yǎng)MSC，并在不斷的傳代培養(yǎng)中得以純化擴(kuò)增。細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)呈梭狀，均勻分布的漩渦狀生長(zhǎng)。傳代周期5D左右，可在體外傳代20代以上，具有強(qiáng)大的增殖能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代的MSC表面標(biāo)志，CD44、CD90分別為9481％，9953％，呈陽(yáng)性高表達(dá)。CD34、CD45、CD11B分別為004％、194％、142％，呈陰性表達(dá)，符合MSC表型。在成骨和成脂的誘導(dǎo)劑條件下，MSC可成功分化為成骨和脂肪細(xì)胞，具有多向分化的能力。DAPI標(biāo)記MSC的陽(yáng)性率達(dá)100％。倒置熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)藍(lán)色熒光標(biāo)志的MSC定位于移植肝內(nèi)。結(jié)論直接貼壁法分離培養(yǎng)MSC簡(jiǎn)單易行，獲得MSC純度高，生物學(xué)特性穩(wěn)定。MSC可以在移植肝內(nèi)存活并定居。第三部分肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子慢病毒的構(gòu)建及對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的修飾目的構(gòu)建攜帶人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HHGF基因的慢病毒，感染MSC，觀察HHGF基因修飾的MSC細(xì)胞MSCHHGF的生物學(xué)行為，體外檢測(cè)MSCHHGF的免疫抑制作用。方法從含HHGF基因的質(zhì)粒中，PCR法獲取HHGF全長(zhǎng)基因，與慢病毒載體分別進(jìn)行酶切，產(chǎn)物定向連接，轉(zhuǎn)化后行PCR鑒定和測(cè)序，構(gòu)建HHGF慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。脂質(zhì)體介導(dǎo)慢病毒載體三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集病毒超濾離心濃縮，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定滴度。將HHGF慢病毒感染MSC，熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)慢病毒感染的效率，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清HHGF分泌水平，細(xì)胞RTPCR檢測(cè)HHGF的MRNA表達(dá)。體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)MLR檢測(cè)MSC和MSCHHGF兩組細(xì)胞的免疫抑制作用。結(jié)果成功構(gòu)建攜帶HHGF基因的慢病毒，滴度達(dá)到1108TUML。HHGF慢病毒高效率感染MSC，最佳MOI值10。流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率達(dá)98％。熒光表達(dá)強(qiáng)，在感染后28DMSC仍穩(wěn)定表達(dá)強(qiáng)烈的綠色熒光。培養(yǎng)上清可檢測(cè)到HHGF因子，在第5D左右達(dá)到高峰，可達(dá)405NGML，這種高水平分泌可持續(xù)到感染后第28D。RTPCR檢測(cè)出HHGFMRNA表達(dá)。MSC組顯著抑制淋巴細(xì)胞的增殖，抑制率達(dá)4634％。而MSCHHGF組抑制率可達(dá)6442％，具有更強(qiáng)的抑制效應(yīng)。結(jié)論通過(guò)慢病毒載體將HHGF基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至MSC細(xì)胞，基因整合到MSC基因組中，并正確轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。HHGF基因修飾的MSC獲得了更強(qiáng)的免疫抑制作用，說(shuō)明HHGF與MSC在體外具有免疫抑制協(xié)同作用。第四部分慢病毒介導(dǎo)HHGF基因修飾MSC對(duì)大鼠同種異體肝移植免疫排斥的影響目的觀察慢病毒介導(dǎo)HHGF基因修飾的MSCMSCHHGF在大鼠體內(nèi)對(duì)同種異體肝移植的免疫排斥反應(yīng)的影響，探討其誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。方法建立穩(wěn)定的同種異體肝移植模型，受體移植成功后，MSCHHGF組立即經(jīng)門(mén)靜脈注入2X106ML的MSCHHGF1ML。MSCGFP組注入2X106ML的MSCGFP1ML。MSC組注入2X106ML的MSC1ML。對(duì)照組注入IML生理鹽水。觀察生存時(shí)間，移植后7D時(shí)檢測(cè)肝功能，取肝臟組織行病理學(xué)檢查，ELISA方法檢測(cè)受體血清中HHGF、IL2、IL4、IL10、IFNΓ等細(xì)胞因子的水平，TUNEL法檢測(cè)肝組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，免疫組化檢測(cè)TNFΑ、NFKB、BC12、PCNA在肝組織內(nèi)的表達(dá)，RTPCR檢測(cè)肝組織內(nèi)HHGF、TNFΑ、NFKB和BC12MRNA的表達(dá)。結(jié)果RTPCR證實(shí)MSCHHGF組肝組織內(nèi)有HHGF基因轉(zhuǎn)錄，并檢測(cè)到綠色熒光表達(dá)，ELISA檢測(cè)血清中HHGF水平可達(dá)62NGML。MSCHHGF組生存時(shí)間100D，MSCGFP組231±39D，MSC組234±31D，均顯著長(zhǎng)于對(duì)照組105±42D。MSCHHGF組和MSC組均能減輕急性排斥反應(yīng)，改善受體狀況。相比MSC組，MSCHHGF組療效更顯著，肝功能明顯改善，病理學(xué)無(wú)急性排斥反應(yīng)或僅輕度，IL2、IFNΓ水平降低，IL4、IL10水平升高，細(xì)胞凋亡明顯減少，BC12表達(dá)和PCNA表達(dá)顯著升高。TNFΑ和NFKB表達(dá)明顯減少。結(jié)論通過(guò)門(mén)靜脈輸注MSCHHGF到大鼠同種異體移植肝內(nèi)是有效可行的，成功誘導(dǎo)出免疫耐受。與單純應(yīng)用MSC比較，MSCHHGF在移植肝局部形成分泌高濃度HHGF免疫抑制微環(huán)境，能更顯著抑制急性排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植受體的存活時(shí)間。HHGF與MSC的免疫抑制協(xié)同作用與誘導(dǎo)TH1細(xì)胞向TH2細(xì)胞偏移、減少致炎因子TNFΑ、NFKB的表達(dá)、減少肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝細(xì)胞增生有關(guān)。

簡(jiǎn)介：Y784005中圖分類(lèi)號(hào)Q784瀘糾壓學(xué)院研究生碩士學(xué)位論文膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定二OO五年五月光度法測(cè)定A260／A280為19?？俁NA未明顯降解。2以提取的總RNA為模板，GDNF的特異性上、下游引物做RTPCR后，瓊脂糖凝膠電泳得約650BP的片段，測(cè)序分析結(jié)果顯示為GDNFCDNA片段。3成功制備感受態(tài)大腸桿菌DH5Ⅱ后，限制性?xún)?nèi)切酶HINDIII、KPNI雙酶切PADTRAEKCMV及，GDNFCDNA，T4DNA連接酶連接酶切產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5Q，接種到含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長(zhǎng)良好，見(jiàn)大量菌斑。4將于卡那霉素陽(yáng)性培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌DH5Q提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，GDNF的特異性上、下游引物做PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳得約650BP的片段。限制性?xún)?nèi)切酶HIN棚I、XPNI酶切提取的質(zhì)粒后，瓊脂糖凝膠電泳得約650BP的片段和9200BP的片段。測(cè)序分析結(jié)果顯示GDNFCDNA插入方向正確，核苷酸序列與GENBANK中大鼠GDNFEDNA序列相同，共插入載體PADTRACKCMV中653BP的基因片段。結(jié)論；本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的PADTRACKCMVGDNFEDNA真核表達(dá)載體，經(jīng)PCR、酶切鑒定和測(cè)序分析證明為目的GDNFCDNA片段，核苷酸序列與GENBANK中大鼠GDNFCDNA序列相同，且連接方向正確。載體構(gòu)建成功。關(guān)鍵詞膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；大鼠；基因重組；載體

簡(jiǎn)介：溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文臺(tái)州地區(qū)兒童?？刹《?0型感染血清流行病學(xué)調(diào)查姓名阮仙利申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)兒科（感染）指導(dǎo)教師朱堅(jiān)勝20071101溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文均發(fā)生了病毒性腦炎的較大規(guī)模流行，經(jīng)初步研究，主要病原為?？刹《?0型。2004年4月1日開(kāi)始，浙江省臨海市發(fā)生了病毒性腦炎的暴發(fā)流行，短期內(nèi)病例數(shù)急劇上升，5個(gè)月病例數(shù)即達(dá)400余例，疫情波及面之廣，發(fā)展之快引起了高度關(guān)注。為了加快病毒性腦炎疫情的控制，更好地保障人民群眾的健康，并為今后病毒性腦炎的疫情控制打下基礎(chǔ)，為此我們建立埃可病毒30型感染的ELISA檢測(cè)方法，對(duì)臺(tái)州地區(qū)的常住人口的兒童作埃可病毒30型血清流行病學(xué)調(diào)查。一、對(duì)象與方法L、對(duì)象選擇臺(tái)州地區(qū)常住入口為研究對(duì)象，9個(gè)縣、市、區(qū)各選擇兒童50例，總共450例，其中男285例、女165例，年齡15歲141例、6～I(xiàn)0歲179例，1I～15歲130例。抽取血液3ML，分離血清作?？刹《?0型特異性抗體一IGM測(cè)定，對(duì)兒童?？刹《?0型感染進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查。2、方法通過(guò)腦脊液標(biāo)本收集后進(jìn)行病毒分離到?？刹《?0型病毒，后克隆、表達(dá)?？刹《?0型VP抗原、純化，建立ELISA檢測(cè)方法，然后對(duì)研究對(duì)象的血清作?？刹《?0型特異性抗體測(cè)定。二、結(jié)果450例兒童血清?？刹《?0型特異性抗體一IGM陽(yáng)性共162例，陽(yáng)性率為36％，不同年齡的陽(yáng)性率分別為1～5歲陽(yáng)性率為43％60／141、6“10歲的陽(yáng)性率為38％68／179、1L“15歲的陽(yáng)性率為26％34／130，其中低年齡兒童卜10歲的陽(yáng)性率為40％，高年齡兒童IL～15歲的陽(yáng)性率為26％，經(jīng)卡方檢驗(yàn)X29。57，有顯著性差異PO05。9個(gè)縣市區(qū)兒童血清?？刹《?0型特異性抗體一IGM陽(yáng)性率有一定的差別，

簡(jiǎn)介：第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)酪氨酸羥化酶（TH）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）基因轉(zhuǎn)導(dǎo)治療帕金森病的實(shí)驗(yàn)研究姓名張旺明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)神經(jīng)外科學(xué)指導(dǎo)教師徐如祥2002515，，’，，7，77，7／’掰寵焦彤穆黲7，∥名≯Z。磊，∥，勿愿穆簟滯哆磐穆夔精嚏氏簸攮777，／7，，R’77，7R’，。，MMMMAOBMFBMMMOIMPPMPTPMRNANGFPCRPDRFPRTSNCSODTHHSVTAINM01／LM01／LMONOAMINEOXIDASEBMEDIALFOREBRAINBUNDIEMINUTEMULRIG’LEOFINFECTIONLMETHYL4PHENYLPYRIDINIRMIONIMETHYL4PHENYIL，2，3，6TETRAHYCROPYRIDINEMESSENGERRNANERVEGROWTHFACTORPOLYMERASECHAINREACTIONPARLDNSON’SDISEASEREDFLUORESCENTPROTEINREVERSETRANSCRIPTIONSECONDSUBSTANTIANIGRAPARSCOMPACTASUPEROXIDEDISMUTASETYROSINEHYDROXYLASETRISHYDROXYAMINOMETHANEVENTRALTEGAMENTALLRCAWEEK毫摩爾／升摩爾／升單胺氧化酶B內(nèi)側(cè)前腦束分鐘感染復(fù)數(shù)卜甲基一4一苯基吡啶離子卜甲基一4一苯基一L，2，3，6一四氫吡啶信使核糖核酸神經(jīng)生長(zhǎng)岡子聚合酶鏈?zhǔn)椒绰榕两鹕〖t色熒光蛋白逆轉(zhuǎn)錄秒黑質(zhì)致密部超氧化物化酶酪氨酸羥化酶三羥基氨基甲烷腹側(cè)被蓋區(qū)周?！啊啊啊啊阿阿阿阿啊阿啊啊阿麺“““M““W“““Ⅻ““2

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多構(gòu)建調(diào)控分泌成熟胰島素的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒.pdf精彩內(nèi)容。