簡介：第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明秉承學(xué)校嚴(yán)謹(jǐn)?shù)男ｏL(fēng)和科研作風(fēng)，本人申明所呈交的論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請學(xué)位論文與資料若有不實之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名壘龐翌日期絲包釜業(yè)目第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解第三軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬第三軍醫(yī)大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為第三軍醫(yī)大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)校可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名蘭趁堡指導(dǎo)教師簽名章鯉日期遜蘭虬舅目錄英文縮寫一覽表1英文摘要2中文摘要5論文正文慢病毒介導(dǎo)的NOTCH配體DELTALRNA干擾對人牙髓干細(xì)胞增殖與分化影響的實驗研究7請『言1／日U舌第一部分人牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定9材料和方法9結(jié)果17討論18第二部分慢病毒介導(dǎo)的DELTALRNAI對DPSCS中DELTAL表達(dá)和NOTCH信號通路的影響19材料與方法19結(jié)果23第三部分DELTALRNAI對人牙髓干細(xì)胞增殖及分化的影響28實驗一DELTALRNAI對人牙髓干細(xì)胞增殖的影響28材料和方法28結(jié)果30實驗二DELTALRNAI對人牙髓干細(xì)胞分化的影響34材料和方法34結(jié)果36討論4L全文結(jié)論43致謝44參考文獻(xiàn)52文獻(xiàn)綜述NOTCH信號通路對牙髓干細(xì)胞的調(diào)控55參考文獻(xiàn)57在讀碩士期間發(fā)表論文59

簡介：人腸道病毒71型HUMANENTEROVIRUS71EV71已被確認(rèn)為是手足口病的主要病原體之一它所具有的嗜皮膚性和嗜神經(jīng)性嚴(yán)重威脅嬰幼兒的健康但目前缺乏特異、高效的抗病毒藥物。許多科技工作者正在研發(fā)各種類型的EV71疫苗包括滅活疫苗、類病毒顆粒疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗但疫苗的研究剛剛起步尚處在動物實驗階段遠(yuǎn)沒有達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。EV71病毒抗體與人腦組織免疫交叉機(jī)制的發(fā)現(xiàn)推測疫苗直接免疫人體可能會引發(fā)神經(jīng)毒副反應(yīng)。所以探索一個能夠口服且無副作用的治療方法迫在眉睫。本課題研究外源給予的不對人體直接免疫口服卵黃抗體的治療方法來防治手足口病。卵黃抗體IGY指特定抗原免疫蛋雞后從雞蛋中提取的針對特定抗原的抗體是生物科學(xué)研究領(lǐng)域的一項重大發(fā)現(xiàn)。自1893年KLEMPERER首次報道雞蛋中存在抗體以來卵黃抗體的研究不斷深入目前卵黃抗體已被廣泛應(yīng)用于許多疾病的防治。受此啟示本課題采用EV71滅活病毒作為抗原分五次免疫母雞水稀釋法提取卵黃抗體ELISA方法檢測抗體滴度結(jié)果顯示EV71卵黃抗體效價在第二次免疫后明顯升高在第三次免疫后一周達(dá)最高峰；通過病毒中和實驗對抗體的抗病毒作用進(jìn)行了研究第三次免疫后1周卵黃抗體的中和指數(shù)是266表明卵黃抗體在細(xì)胞水平具有良好的抗病毒作用且該抗體對4種不同來源的C4亞型毒株均具有不同的抗病毒作用。我們的研究證實90％蛋雞經(jīng)免疫后均可產(chǎn)生中和指數(shù)大于24的中和抗體可以用于大規(guī)模生產(chǎn)。由此可見雞免疫EV71后可產(chǎn)生具有良好體外抗病毒效果的卵黃抗體。而且卵黃抗體具有取材方便、提取方法比較簡單、產(chǎn)量高等優(yōu)點實驗條件簡單適合大規(guī)模生產(chǎn)。本研究為手足口病重點防治及重癥患者的急救提供了抗體治療的思路。2009年4月始發(fā)于墨西哥和美國的流感是由一種新型甲型H1N1流感病毒引起的急性熱性呼吸道傳染病短短數(shù)月疫情蔓延全球但在不同地區(qū)報道的重癥患者和病死率有較大差異可能與病毒基因多態(tài)性有關(guān)因此本文研究2009年甲型H1N1流感病毒基因序列多態(tài)性對病毒復(fù)制及毒力的影響。病毒復(fù)制分析在MDCK細(xì)胞中進(jìn)行毒力和致病性實驗在BALBC小鼠體內(nèi)進(jìn)行。選擇ACALIFNIA042009ASICHUAN12009和ABEIJING32009三株病毒分別感染MDCK細(xì)胞48小時后ASICHUAN12009病毒株的病毒RNA載量顯著高于其他兩株P(guān)005；同時滴鼻接種BALBC小鼠觀察發(fā)病情況及存活率觀察期為14天80的小鼠在接種ASICHUAN12009病毒后死亡ACALIFNIA042009毒株感染后的存活率是60?EIJING32009病毒株感染后沒有出現(xiàn)死亡小鼠。感染后5天當(dāng)病毒擴(kuò)散達(dá)高峰時接種ASICHUAN12009株病毒液的小鼠肺組織病毒RNA載量顯著高于其他兩種毒株P(guān)005；通過切片、HE染色、鏡下觀察三種毒株感染小鼠的肺組織均有充血、出血、水腫、滲出等炎癥病理變化。接種ASICHUAN12009病毒株的小鼠100肺組織出現(xiàn)病變接種ACALIFNIA042009病毒株的小鼠85肺組織出現(xiàn)病變接種ABEIJING32009病毒株的小鼠肺組織出現(xiàn)病變的發(fā)生率是60。另一方面對三株病毒的全基因組進(jìn)行測序及序列比對對其基因突變情況及多態(tài)性進(jìn)行分析。ASICHUAN12009株全基因中有5個氨基酸發(fā)生了突變其中PA蛋白中343位點的A突變?yōu)門PB1蛋白中353位點的K突變?yōu)镽566位點的T突變?yōu)锳PB2蛋白中471位點的T突變?yōu)镸對病毒毒力的增強(qiáng)起重要作用。在本研究中體內(nèi)和體外實驗表明全基因組序列的多態(tài)性可能是決定2009年甲型H1N1流感病毒復(fù)制能力毒力及致病性不同的關(guān)鍵因素之一。2009年8月根據(jù)香港最新的流感流行病學(xué)調(diào)查H1N1亞型流感病毒占全部人際間流行株的49顯示該病毒已成主流流行株。因此建立H1N1流感病毒感染的動物模型尤其是從經(jīng)濟(jì)角度及遺傳背景角度最優(yōu)的BALBC小鼠模型對于疾病機(jī)理的深入研究及新藥和疫苗的臨床前檢定都具有非常重要的意義。然而野生型季節(jié)性流感病毒H1N1通過常規(guī)接種方式并不能感染小鼠但研究發(fā)現(xiàn)通過將低毒力的病毒對小鼠肺組織進(jìn)行連續(xù)傳代有望獲得毒力顯著增強(qiáng)的鼠肺適應(yīng)株病毒。本實驗用毒力較弱的野生型季節(jié)性流感H1N1病毒滴鼻感染小鼠通過在BALBC小鼠肺組織中連續(xù)傳代觀察小鼠存活情況及肺病理改變來獲得季節(jié)性流感病毒H1N1的鼠肺適應(yīng)株及重癥感染模型。季節(jié)性流感H1N1ABRISBANE592007病毒野生型毒株經(jīng)過在小鼠體內(nèi)進(jìn)行8次傳代后毒力逐漸增強(qiáng)從無致病力到致死率達(dá)到100。對鼠肺適應(yīng)株與野生型毒株進(jìn)行基因比對發(fā)現(xiàn)適應(yīng)株HA基因發(fā)生了3個有義突變最主要的是第89個位點上THR至ILE氨基酸的改變。本實驗對導(dǎo)致毒力增強(qiáng)的分子機(jī)制進(jìn)行了研究為季節(jié)性流感病毒致病機(jī)理的深入研究尤其是流感病毒的跨物種傳播機(jī)制以及在此過程中所發(fā)生的環(huán)境選擇壓力下流感病毒的分子進(jìn)化行為均可提供重要的理論指導(dǎo)同時基于鼠肺適應(yīng)株建立的重癥小鼠感染模型對于相關(guān)新藥和疫苗的臨床前評價都具有廣闊及重要的實際應(yīng)用價值。

簡介：鑒于西苑醫(yī)院心血管科在八五攻關(guān)課題保心康口服液后改名芪冬頤心口服液與九五攻關(guān)課題生脈散細(xì)粒劑治療病毒性心肌炎進(jìn)行了臨床研究積累了較豐富的治療經(jīng)驗認(rèn)為從中醫(yī)傳統(tǒng)理論出發(fā)針對病毒性心肌炎患者素體虛弱又有外感毒邪內(nèi)侵故能由衛(wèi)入營、由肺及心毒邪內(nèi)熾耗氣傷陰導(dǎo)致該病大多以氣陰兩虛為本邪毒侵心為標(biāo)的病證特點故以扶正祛邪標(biāo)本兼顧的治療原則可望進(jìn)一步提高臨床療效采用生脈散加味方以益氣養(yǎng)陰清熱解毒作為治療病毒性心肌炎的根本方劑進(jìn)行了臨床觀察該研究結(jié)果表明生脈散加味方對輕、中度病毒性心肌炎氣陰兩虛型患者均有良好的臨床療效在改善患者的臨床癥狀糾正異常心電圖、降低血清心肌酶、抑制柯薩奇病毒的復(fù)制、改善左心室功能等方面優(yōu)于對照組生脈飲口服液雖然生脈飲口服液也具有較好的臨床療效但畢竟勢單力薄很難適應(yīng)臨床病證的所有變化因此結(jié)合辨證加味以便充分發(fā)揮生脈散的治療作用進(jìn)一步提高臨床療效具有一定的臨床實用意義

簡介：目的檢測乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBVDNA在HBSAG、HBEAG陽性孕婦卵巢組織中的表達(dá)及HBVDNA含U5序列在孕婦及其新生兒中的垂直傳遞，進(jìn)一步研究HBV通過生殖細(xì)胞的垂直傳遞，探討HBV垂直傳遞的機(jī)制。方法取21例HBSAG、HBEAG陽性孕婦及20例正常對照孕婦的卵巢組織和對應(yīng)的新生兒臍帶血，對卵巢組織石蠟包埋、切片，免疫組化SP法技術(shù)檢測HBSAG的表達(dá)情況；并對實驗組和對照組卵巢組織利用顯微分離技術(shù)分離卵泡，提取卵泡DNA及臍血DNA，PCR技術(shù)檢測HBVDNA。結(jié)論①在國內(nèi)外研究中首次以乙肝陽性孕婦的卵巢組織及其新生兒臍帶血為實驗材料，在卵巢皮質(zhì)卵泡細(xì)胞中檢測到HBSAG的表達(dá)，與對照組相比有高度統(tǒng)計學(xué)意義；②本研究結(jié)果證明，乙肝病毒可通過生殖細(xì)胞傳播，孕婦卵泡組織、臍血HBVDNA感染率為75﹪68，與正常對照組比較有高度統(tǒng)計學(xué)意義；③孕婦感染乙肝病毒是卵巢組織受到感染的原因，其感染方式可能系血液傳播。

簡介：本文通過對輪狀病毒腹瀉小兒特異性體液免疫應(yīng)答和TH1TH2細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究，深入認(rèn)識小兒感染輪狀病毒后特異性免疫應(yīng)答的特點；通過對病原體識別受體TLR的研究探討輪狀病毒感染后天然免疫應(yīng)答的特點，為建立輪狀病毒感染有效預(yù)防和治療的方法提供理論依據(jù)。研究表明1急性輪狀病毒感染小兒早期出現(xiàn)的免疫應(yīng)答中，以特異性體液免疫，尤其是粘膜免疫的顯著增強(qiáng)為主要特點；細(xì)胞免疫應(yīng)答以TH1反應(yīng)為早期特征。2輪狀病毒感染至少可誘導(dǎo)5種TLR表達(dá)升高，并促使效應(yīng)細(xì)胞因子IFNΓ顯著增加，提示TLR在輪狀病毒的初始抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。3輪狀病毒腹瀉和菌痢病人外周血單個核細(xì)胞TLR表達(dá)有明顯差異，不同病毒、細(xì)菌體外感染細(xì)胞后TLR的表達(dá)譜有明顯不同，顯示了不同病原體通過不同的TLR啟動宿主的免疫應(yīng)答；TLR通過促使不同細(xì)胞因子的產(chǎn)生，啟動并參與感染性腹瀉患兒的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。

簡介：分類號分類號R39211密級公開密級公開雙靶向融合蛋白增強(qiáng)腎癌腺病毒疫苗免疫雙靶向融合蛋白增強(qiáng)腎癌腺病毒疫苗免疫活性的實驗研究活性的實驗研究ENHANCEDIMMUNOLOGICALACTIVITYOFADENOVIRUSVACCINEFRENALCELLCARCINOMAUSINGANOVELDOUBLETARGETEDFUSIONPROTEIN作者姓名田仁禮作者姓名田仁禮學(xué)科學(xué)科專業(yè)外科學(xué)（泌尿外專業(yè)外科學(xué)（泌尿外科）導(dǎo)師師高江平高江平教授教授指導(dǎo)老師于繼云指導(dǎo)老師于繼云研究員研究員答辯委員會主席答辯委員會主席論文答辯日論文答辯日期二〇一四年五月十四日一四年五月十四日院校地址北京市復(fù)興路院校地址北京市復(fù)興路28號郵政編碼郵政編碼100853解放軍醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明秉承我院“敬業(yè)、勤奮、求實、創(chuàng)新”的學(xué)風(fēng)，本人聲明所呈交的論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得我院或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位及證書而使用過的材料，對本文的研究作出貢獻(xiàn)的個人或集體，均已在文中做了明確的說明并表示謝意。申請學(xué)位論文與資料若有不實之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名日期指導(dǎo)教師簽名日期解放軍醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人保證畢業(yè)離院后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為解放軍醫(yī)學(xué)院或解放軍總醫(yī)院。學(xué)院有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文原件、復(fù)印件和電子版本，可以采用影印、縮印、掃描或其它手段保存論文以供被查閱和借閱。學(xué)院可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容（保密內(nèi)容除外）。論文作者簽名日期指導(dǎo)教師簽名日期

簡介：點擊查看更多乙肝病毒重組抗原表全的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：本研究旨在采用BACTOBAC重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)將復(fù)制型HBV基因組轉(zhuǎn)入HEPG2細(xì)胞，建立HBV中國株及其有關(guān)變異株的重組桿狀病毒HEPG2細(xì)胞系統(tǒng)，并應(yīng)用該系統(tǒng)初步評價抗病毒藥物拉米夫定對HBV表達(dá)及復(fù)制的影響。材料和方法將12倍HBV基因組血清ADR型、基因C型連接至桿狀病毒的轉(zhuǎn)移載體PFASTBACI上，然后轉(zhuǎn)化入DH10BAC菌株中，在細(xì)菌內(nèi)的HELPER質(zhì)粒輔助作用下與桿狀病毒基因組BAC發(fā)生位點特異性轉(zhuǎn)座，形成含有HBV基因組的重組BAC，轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞后，包裝產(chǎn)生HBV重組桿狀病毒VACHBVC。采用連續(xù)PCR引入方法進(jìn)行定點突變，構(gòu)建YVDD變異株質(zhì)粒，并按照上述方法構(gòu)建HBVYVDD異株重組桿狀病毒VACHBVCYVDD。同時，為便于觀察轉(zhuǎn)染效率及病毒滴度測定，將HBV基因組重組入帶有綠色熒光蛋白EGFP基因的轉(zhuǎn)移載體PFASTBACDUALEGFP，從而構(gòu)建得到可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白的HBV重組桿狀病毒VACGFPHBVC。

簡介：實驗性自身免疫性甲狀腺炎EXPERIMENTALAUTOIMMUHYROIDITIS，EAT由于與人類橋本甲狀腺炎具有相似的病理特征與疾病進(jìn)程，因此常作為研究橋本甲狀腺炎發(fā)病機(jī)理的動物模型。EAT是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的以甲狀腺上皮細(xì)胞變性、壞死、纖維化并伴有大量單個核細(xì)胞浸潤為病理特征的免疫性炎癥。在甲狀腺組織中，MHCⅡ類分子異常表達(dá)，CD4T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量局部浸潤、致炎因子分泌增加，導(dǎo)致抗甲狀腺球蛋白自身反應(yīng)性T細(xì)胞的激活是造成正常甲狀腺損傷的主要原因。因此，有可能通過靶向性抑制CⅡTA的表達(dá)，下調(diào)MHCⅡ類分子的表達(dá)及其對自身抗原肽的遞呈，達(dá)到對EAT進(jìn)行防治的目的。有鑒于此，本研究旨在1通過構(gòu)建CⅡTA突變體的重組腺病毒，觀察其對MHCⅡ類分子組成性和誘導(dǎo)性表達(dá)的抑制作用；2研究CⅡTA突變體基因轉(zhuǎn)移在預(yù)防和治療EAT中的效果及其可能機(jī)制。本研究設(shè)計了一種小鼠Ⅳ型CⅡTA的突變體，造成其N端第109226位氨基酸的缺失突變。用常規(guī)分子生物學(xué)方法和重疊延伸PCR法OEPCR構(gòu)建了該突變體的兩種腺病毒表達(dá)載體PADEASY1系統(tǒng)，即PADCMVCⅡTAM和PADPⅣCⅡTAM；腺病毒載體經(jīng)HEK293細(xì)胞包裝產(chǎn)生含CⅡTA突變體的重組腺病毒ADCMVCⅡTAM和ADPⅣCⅡTAM，用氯化銫密度梯度離心法獲得純化的高滴度腺病毒；采用多種方法對重組腺病毒進(jìn)行了定量檢測與活性評價；并將ADCMVCⅡTAM和ADPⅣCⅡTAM分別感染SVEC細(xì)胞與J774細(xì)胞，觀察其對誘導(dǎo)性與組成性MHCⅡ類分子表達(dá)的抑制；用純化的豬甲狀腺球蛋白免疫CBAJ小鼠，誘導(dǎo)實驗性自身免疫性甲狀腺炎模型的產(chǎn)生，并分別于免疫后0～2天與14～16天經(jīng)尾靜脈注射重組腺病毒，觀察CⅡTA突變體對實驗性自身免疫性甲狀腺炎的預(yù)防與治療效果及其機(jī)制。本研究包括三個部分第一部分CⅡTA突變體重組腺病毒載體的構(gòu)建、擴(kuò)增、純化和滴度測定本部分內(nèi)容中有關(guān)重組腺病毒的構(gòu)建和包裝的實驗內(nèi)容由本實驗室2005屆碩士研究生管政完成。采用重疊延伸PCR法OEPCR造成CⅡTA基因N端第325678位堿基的缺失突變，克隆到PIRES上，得到重組質(zhì)粒PIRESCⅡTAM。構(gòu)建ADCMVCⅡTAM時，將PIRESCⅡTAM克隆到PADTRACK穿梭質(zhì)粒上，經(jīng)PMEI線性化后轉(zhuǎn)入BJADEASY1感受態(tài)菌中進(jìn)行同源重組，獲得PADCMVCⅡTAM重組腺病毒骨架質(zhì)粒。構(gòu)建ADPⅣCⅡTAM時，先構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒PSHUTTLEPⅣ并將CⅡTAM克隆到其中，得到PSHUTTLECⅡTAMPⅣ，經(jīng)PMEI線性化后轉(zhuǎn)入BJADEASY1感受態(tài)菌中進(jìn)行同源重組，獲得PADPⅣCⅡTAM重組腺病毒骨架質(zhì)粒。將PADCMVCⅡTAM和PADPⅣCⅡTAM分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，當(dāng)出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時收獲培養(yǎng)上清及細(xì)胞反復(fù)凍融后的細(xì)胞裂解液上清，獲得完整的病毒顆粒。本部分構(gòu)建的重組腺病毒載體為進(jìn)行顯性失活CⅡTA突變體抑制CⅡTA基因表達(dá)，定量下調(diào)MHCⅡ類分子的表達(dá)，以及防治自身免疫性疾病動物模型打下了基礎(chǔ)。通過半數(shù)組織細(xì)胞病變法TCID50、流式細(xì)胞術(shù)和實時熒光定量PCR法測定了經(jīng)CSCL雙密度梯度超速離心純化的重組腺病毒的感染活性與實際病毒顆粒數(shù)。兩組方法之間的差距平均不超過102倍，且兩組方法內(nèi)之間的結(jié)果具有明顯的可比性，表明了經(jīng)純化的重組腺病毒具有較穩(wěn)定的性質(zhì)。由于測定感染活性的方法往往缺乏客觀的判斷標(biāo)準(zhǔn)，且耗時耗力，較易引起誤差，而測定病毒實際顆粒數(shù)的方法又不能反映病毒的感染活性，因此我們推薦在測定病毒滴度時運用多種方法聯(lián)合評價。由于我們純化的病毒活性比較高，為了保持后續(xù)實驗的重復(fù)性，我們使用了實際病毒顆粒數(shù)作為劑量標(biāo)準(zhǔn)。第二部分CⅡTA突變體重組腺病毒的表達(dá)調(diào)控和體外功能研究本部分首先使用小鼠IFNΓ分別對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞株SVEC和小鼠巨噬細(xì)胞株J774進(jìn)行刺激，觀察IFNΓ對MHCⅡ類分子表達(dá)的作用。發(fā)現(xiàn)小鼠IFNΓ能夠誘導(dǎo)SVEC細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ類分子IAK，且隨劑量的增大而使其表達(dá)升高；J774細(xì)胞組成性表達(dá)MHCⅡ類分子IAD，但小鼠IFNΓ對J774細(xì)胞MHCⅡ類分子的表達(dá)有明顯增強(qiáng)作用。分別用重組腺病毒ADCMVCⅡTAM和ADPⅣCⅡTAM轉(zhuǎn)染SVEC和J774細(xì)胞，同時以空載病毒ADGFP作為對照，觀察它們對誘導(dǎo)性與組成性MHCⅡ類分子表達(dá)的抑制作用，同時觀察野生型CⅡTAMRNACⅡTAWT和突變型CⅡTAMRNACⅡTAM表達(dá)的差異。研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體介導(dǎo)ADCMVCⅡTA和ADPⅣCⅡTAM轉(zhuǎn)染J774細(xì)胞后，表達(dá)MHCⅡ類分子的細(xì)胞陽性率明顯下降；ADCMVCⅡTA和ADPⅣCⅡTAM感染SVEC細(xì)胞后，對IFNΓ刺激作用的敏感性明顯降低，表達(dá)MHCⅡ類分子的細(xì)胞陽性率顯著降低。上述結(jié)果證實了重組腺病毒ADCMVCⅡTA和ADPⅣCⅡTAM能夠有效抑制組成性與誘導(dǎo)性MHCⅡ類分子的表達(dá)。實時定量RTPCR同時檢測這些細(xì)胞中CⅡTAWT、CⅡTAM的MRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CⅡTAWT的表達(dá)受ⅡFNΓ的明顯誘導(dǎo)或增強(qiáng)，且腺病毒轉(zhuǎn)染對CⅡTAWTMRNA表達(dá)水平影響不大。這說明，CⅡTA突變體抑制MHCⅡ類分子的表達(dá)，并不是通過減少CⅡTAWT的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。我們認(rèn)為，可能是野生型CⅡTA與MHCⅡ啟動子區(qū)上的穩(wěn)定小體的結(jié)合受到突變型CⅡTA蛋白的強(qiáng)烈競爭，從而降低了MHCⅡ類分子的轉(zhuǎn)錄活性。ADCMVCⅡTAM感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，CⅡTAMMRNA有較高水平的表達(dá)，而ADPⅣCⅡTAM感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，CⅡTAMMRNA表達(dá)水平很低，需IFNΓ刺激才能有高水平表達(dá)。這證實ADPⅣCⅡTAM中CⅡTAMMRNA的表達(dá)是IFNΓ依賴性的。第三部分腺病毒介導(dǎo)CⅡTA突變體基因轉(zhuǎn)移防治實驗性自身免疫性甲狀腺炎的研究選擇6周齡的CBAJ小鼠，分別于0天和第7天皮下注射100ΜG純化的豬甲狀腺球蛋白及CFAIFA，制備實驗性自身免疫性甲狀腺炎動物模型。分別于初次免疫后0～2天與14～16天經(jīng)小鼠尾靜脈注射重組腺病毒ADCMVCⅡTAM和ADPⅣCⅡTAM單次劑量為5109VP只作為預(yù)防實驗組與治療實驗組，并同時以空載病毒ADGFP作為其各自的對照組，再設(shè)立單純免疫組與正常組對照。小鼠于初次免疫后第28天眼球取血后，脫頸處死，解剖獲取甲狀腺與脾臟。甲狀腺病理檢查判斷甲狀腺病損程度，測定小鼠血漿抗甲狀腺球蛋白抗體的滴度與總IGG的量判斷小鼠的體液免疫功能，測定小鼠脾臟單個核細(xì)胞對CONA和甲狀腺球蛋白刺激的增殖能力及細(xì)胞因子的分泌能力反映小鼠細(xì)胞免疫功能，免疫組化測定小鼠甲狀腺組織中浸潤單個核細(xì)胞與甲狀腺組織中MHCⅡ類分子的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)測定脾及外周血的淋巴細(xì)胞亞群與MHCⅡ類分子、ICOS的表達(dá)。結(jié)果顯示在預(yù)防性實驗組，以ADCMVCⅡTAM處理的小鼠甲狀腺病損程度明顯減輕，誘導(dǎo)表達(dá)的MHCⅡ類分子明顯受抑，自身抗體與總IGG水平均明顯下降，脾單個核細(xì)胞對甲狀腺球蛋白的刺激明顯受抑，外周血與脾臟中活化T細(xì)胞上的MHCⅡ類分子的表達(dá)及活化T細(xì)胞數(shù)均明顯減少，細(xì)胞因子IFNΓ和IL2降低。這表明早期使用重組腺病毒ADCMVCⅡTAM能夠有效防止自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)生。在治療性實驗組，以ADCMVCⅡTAM處理的小鼠表現(xiàn)出甲狀腺病損程度減輕、脾單個核細(xì)胞對甲狀腺球蛋白刺激的應(yīng)答明顯受抑，自身抗體的滴度明顯下降，活化T細(xì)胞上的MHCⅡ類分子的表達(dá)量及活化T細(xì)胞數(shù)均明顯減少，但甲狀腺濾泡細(xì)胞上仍有一定水平的MHCⅡ類分子的表達(dá)。這些結(jié)果表明發(fā)病后應(yīng)用ADCMVCⅡTAM治療能夠明顯減輕甲狀腺炎的病損程度，對甲狀腺炎具有一定的治療效果。以ADPⅣCⅡTAM代替ADCMVCⅡTAM進(jìn)行預(yù)防或治療EAT，結(jié)果顯示ADPⅣCⅡTAM的效果接近ADCMVCⅡTAM，能有效預(yù)防及治療EAT。這說明CⅡTAM基因在PⅣ啟動子調(diào)控下，在EAT病理發(fā)生過程能有效表達(dá)，并發(fā)揮抑制MHCⅡ表達(dá)及其抗原遞呈功能，進(jìn)而減輕EAT的病理程度。在本研究中，我們使用的ADCMVCⅡTAM和ADPⅣCⅡTAM在不同病理時期對EAT進(jìn)行預(yù)防或治療均取得了較好的效果，這為臨床治療橋本甲狀腺炎提供了有意義的啟示。

簡介：流行性感冒是嚴(yán)重影響人類健康的最常見的原因之一。進(jìn)入21世紀(jì)以來，2006年的H5N1型禽流感、今年爆發(fā)流行的H1N1型流感，都給人類的工作和生活帶來嚴(yán)重影響。正因如此，流感病毒致病機(jī)理的研究一直都是醫(yī)學(xué)研究的熱點。目前，為廣大學(xué)者所接受的致病機(jī)理中，流感病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷機(jī)制都是重要的學(xué)說，但關(guān)于兩種機(jī)制之間關(guān)系的研究國內(nèi)外未見報道。其它領(lǐng)域的研究證明，氧化應(yīng)激可通過多條途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。XUJJ等人通過對培養(yǎng)的心肌細(xì)胞研究，證明了氧化應(yīng)激與凋亡之間的關(guān)系1；研究還發(fā)現(xiàn)在非肥胖糖尿病鼠胰島中存在過度氧化所致的凋亡現(xiàn)象2。在立足國內(nèi)外研究進(jìn)展和流感病毒致病機(jī)制的基礎(chǔ)上，本研究將從新的視角探討流感病毒所致的細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激損傷之間的關(guān)系。目的本課題旨在證明研究氧化應(yīng)激損傷在流感病毒感染并最終致宿主細(xì)胞凋亡的過程中的存在；流感病毒感染宿主細(xì)胞可導(dǎo)致脂質(zhì)氧化損傷和DNA、RNA堿基氧化損傷。同時，通過對宿主細(xì)胞氧化損傷程度與流感病毒致宿主細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系研究，揭示流感病毒致宿主細(xì)胞的氧化損傷在宿主細(xì)胞凋亡中的作用。加強(qiáng)對流感病毒致宿主細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制的認(rèn)識，為該病毒致病機(jī)理研究提供了新的思路，為抗流感藥物的開發(fā)提供新的靶點，也為高致病性人禽流感的預(yù)防、防控提供了新的視角和依據(jù)。方法第一部分流感病毒實驗用毒劑量確定雞胚尿囊腔接種H1N1型流感病毒，經(jīng)病毒復(fù)制、擴(kuò)增、收獲病毒，通過檢測MDCK細(xì)胞的半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量（TCID50），確定該毒株實驗用毒劑量，并經(jīng)預(yù)試驗給予驗證。第二部分流感病毒感染MDCK細(xì)胞后的凋亡率檢測利用ANNEXINVFITCPI試劑盒檢測病毒感染MDCK細(xì)胞1H后繼續(xù)培養(yǎng)0H、1H、3H、6H、12H、24H、48H各時間點的凋亡率。第三部分流感病毒感染MDCK細(xì)胞后MDA的含量檢測利用MDA檢測試劑盒檢測病毒感染MDCK細(xì)胞1H后繼續(xù)培養(yǎng)0H、1H、3H、6H、12H、24H、48H各時間點的MDA含量。第四部分流感病毒感染MDCK細(xì)胞后8OXOG表達(dá)情況檢測細(xì)胞爬片經(jīng)過不同的預(yù)處理，利用免疫組織化學(xué)染色SP法檢測病毒感染MDCK細(xì)胞1H后繼續(xù)培養(yǎng)0H、1H、3H、6H、12H、24H、48H各時間點的DNA中的8OXOG和RNA中8OXOG表達(dá)情況。結(jié)果1該毒株感染MDCK細(xì)胞的TCID50為104501ML，經(jīng)預(yù)實驗驗證確定毒株的實驗用毒劑量為100TCID50。2該毒株的實驗用毒劑量能感染并誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞的凋亡，且凋亡率隨著檢測時間延長呈上升趨勢，前6H凋亡率與對照組無明顯差異（P005），12H凋亡率開始上升達(dá)6422％±0326（P＜001），24H、48H分別為9570％±0229、9178％±0286，與對照組有明顯差異（P＜001）。3病毒感染細(xì)胞后，MDA含量隨著檢測時間的延長而下降，0HMDA水平達(dá)高峰1490±0053NMOLMGPROT（P＜001），16H維持在較高水平，依次為1221±0036NMOLMGPROT，1157±0061NMOLMGPROT，1089±0038NMOLMGPROT（P＜001），12H后MDA水平明顯下降至0636±0033NMOLMGPROT（P＜001），24H、48HMDA水平與對照組比較無顯著性差別（P005）。4該毒株感染MDCK細(xì)胞后，能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞DNA和RNA中8OXOG的表達(dá)。DNA中8OXOG表達(dá)情況如下含8OXOG的陽性細(xì)胞百分比隨著時間呈明顯上升趨勢（P＜005）。0H陽性細(xì)胞百分比已達(dá)1220±316（P＜005），之后的1H、3H、6H、12H、24H陽性細(xì)胞百分比逐漸上升各時間點陽性細(xì)胞百分比與對照組差異明顯（P＜001），48H陽性細(xì)胞百分比達(dá)到最高8745±398（P＜001）。RNA中8OXOG表達(dá)情況如下該毒株感染細(xì)胞之后，RNA中8OXOG表達(dá)情況隨時間呈明顯上升趨勢（P＜005），各時間點實驗組8OXOG陽性細(xì)胞表達(dá)情況依次為993±145；1238±192；2670±086；4655±292；5889±202；7272±213；8063±097（P＜001）。同時，細(xì)胞DNA中8OXOG陽性百分比在1H、3H、6H、12H明顯高于同時間點細(xì)胞RNA中。結(jié)論經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)H1N1型流感病毒能明顯誘導(dǎo)宿主MDCK細(xì)胞凋亡，凋亡率隨著檢測時間延長升高；H1N1型流感病毒感染宿主MDCK細(xì)胞過程中存在脂質(zhì)氧化損傷，丙二醛濃度隨檢測時間推移呈下降趨勢，且凋亡率和MDA含量有高度三次方線性關(guān)系，關(guān)系方程為Y2309－4217X2982X2－716X3，曲線的決定系數(shù)R2為099880；H1N1型流感病毒感染宿主MDCK細(xì)胞之后引起細(xì)胞DNA和RNA鳥嘌呤的氧化損傷產(chǎn)物8OXOG的高表達(dá)，且在DNA中的陽性百分比明顯強(qiáng)于RNA中的，這是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡因素之一。

簡介：第一部分HBSAG重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)論1成功構(gòu)建了復(fù)制缺陷型HBSAG重組腺病毒ADS及對照重組腺病毒ADGFP和ADLACZ2重組腺病毒ADS能高效轉(zhuǎn)染HBVS基因并主要在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)目的蛋白第二部分HBSAG重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠樹突狀細(xì)胞體內(nèi)免疫功能的研究結(jié)論1證實ADS體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠DC不影響DC表型成熟、同種異體和自體T細(xì)胞刺激活性及誘導(dǎo)TH1TC1Ⅰ型細(xì)胞應(yīng)答的作用2ADS轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC免疫小鼠后2周左右能增強(qiáng)小鼠Ⅰ型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)比DNA疫苗更強(qiáng)的TH1細(xì)胞應(yīng)答以及比HBSAG蛋白沖擊DC和DNA疫苗更強(qiáng)的TC1和特異性CTL反應(yīng)是誘導(dǎo)抗HBV細(xì)胞免疫的有效刺激細(xì)胞3ADS轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC疫苗增強(qiáng)小鼠抗HBV細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用近期效應(yīng)較強(qiáng)但持續(xù)時間和誘導(dǎo)抗HBS作用不如DNA疫苗可根據(jù)治療要求考慮聯(lián)合其它方法第三部分S基因修飾的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抗HBV免疫的研究結(jié)論1ADS轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC能誘導(dǎo)比HBSAG蛋白沖擊DC及DNA疫苗更強(qiáng)的Ⅰ型免疫應(yīng)答和特異性CTL免疫對HBVTG小鼠血清HBSAG、HBVDNA水平和肝臟組織HBCAG和HBSAG的表達(dá)有較迅速和明顯的抑制作用2證實ADS轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC疫苗抗HBV作用突出表現(xiàn)在免疫后2周左右至少4周內(nèi)其作用效果優(yōu)于HBSAG蛋白沖擊DC和DNA免疫是有較好應(yīng)用前景的慢性乙型肝炎的治療性疫苗相關(guān)研究迄今未見文獻(xiàn)報道3ADS轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC誘導(dǎo)血清抗HBS作用不足可考慮聯(lián)合其它治療方法其免疫作用的持續(xù)性也有行待進(jìn)一步優(yōu)化和增強(qiáng)

簡介：點擊查看更多銀杏葉提取物（舒血寧）對老年病人全身麻醉術(shù)后認(rèn)知功能的作用.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的研究外部引導(dǎo)序列（EXTERNALGUIDESEQUENCES，EGS）對人巨細(xì)胞病毒（HUMANCYTOMEGALOVIRUS，HCMV）臨床病毒株UL148基因表達(dá)的抑制作用，為探討UL148基因功能奠定基礎(chǔ)，為抗HCMV治療尋找新的治療途徑。方法細(xì)胞外實驗1根據(jù)靶基因UL148序列特征設(shè)計并合成DNA性質(zhì)EGS；2從HCMV臨床病毒株基因組中擴(kuò)增UL148基因，克隆入PGEMTEASY質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增UL148小片段，制備底物轉(zhuǎn)錄模板，參入32PUTP后體外轉(zhuǎn)錄；3從大腸桿菌DH5Α基因組擴(kuò)增M1RNA基因，將其克隆入PUC18質(zhì)粒，線性化后，體外合成M1RNA；4將底物UL148RNA、EGS、M1RNA混合于切割反應(yīng)液，37℃反應(yīng)1H，以聚丙烯酰胺凝膠分離產(chǎn)物，應(yīng)用TYPHOONS掃描儀分析切割結(jié)果。細(xì)胞內(nèi)實驗將UL148基因克隆入PEGFPN1質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞，同時以PEGFPN1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞作為陰性對照，均以1MGMLG418篩選4周。選取細(xì)胞外實驗證實有切割作用的EGS4，分別以50NM、100NM、200NM、400NM終濃度轉(zhuǎn)染G418篩選后的細(xì)胞。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察上述細(xì)胞熒光量的變化；應(yīng)用熒光定量PCR進(jìn)行絕對定量，分析EGS4對UL148表達(dá)量的沉默效果。結(jié)果細(xì)胞外實驗1共設(shè)計5條EGS；2成功構(gòu)建PT148重組質(zhì)粒，PCR后擴(kuò)增獲得UL148小片段轉(zhuǎn)錄模板，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得32P標(biāo)記的UL148小片段RNA；3成功構(gòu)建PUCM1重組質(zhì)粒，線性化后，體外轉(zhuǎn)錄合成M1RNA；4在細(xì)胞外進(jìn)行切割實驗，篩選出多條具有特異性切割UL148RNA的EGS。細(xì)胞內(nèi)實驗成功構(gòu)建P148EGFP重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒P148EGFP及PEGFPN1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)UL148基因的HELA細(xì)胞系（UL148HELA）和穩(wěn)定表達(dá)EGFP的HELA細(xì)胞系（EGFPHELA）。熒光顯微鏡觀察50NM、100NM、200NM、400NM的EGS4作用后，UL148HELA細(xì)胞的熒光量明顯減少，而EGFPHELA細(xì)胞熒光量無明顯改變。熒光定量PCR分析顯示50NM、100NM、200NM、400NMEGS4對UL148的抑制效率分別為749％P結(jié)論1經(jīng)細(xì)胞外實驗篩選出2條具有特異性切割UL148RNA作用的EGS，分別為EGS1和EGS4；2在細(xì)胞內(nèi)EGS4能有效沉默HCMVUL148基因的表達(dá)，并隨濃度的增加，沉默效果逐漸明顯；3細(xì)胞外EGS切割實驗系統(tǒng)可作為細(xì)胞內(nèi)切割實驗前的一種有效篩選途徑；4經(jīng)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)切割實驗篩選出的有效EGS可用于研究UL148的基因功能，并且有望發(fā)展成為抗HCMV的小分子核酸藥物。

簡介：研究生個人簡介茆飛，男，28歲，江蘇省宿遷人。2010年到2013年攻讀徐州醫(yī)學(xué)院泌尿外科學(xué)科研碩士研究生，導(dǎo)師為鄭駿年教授。研究生期間修滿學(xué)分31分。通過國家CET6考試。獲得國家執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格。徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文縮略詞表縮略詞英文全稱AMPAN幣K／LLINCPECYTOPATHIEEFFECTCRADSCONDITIONALLYREPLICATIVEADENOVIRUSDABDIAMINOBENZIDINEDMEMDULBEC．,CO’SMODIFRAIEAGLEMEDIUMDMSODIMETHYLSULFOXIDEDNADEO蛐ONUCLEICACIDDNTPDEOXYR玉ONUCLEOSIDETRIPHOSPHATEEBETHIDIUMBROMIDEEDTAETH啦ITEDIAMINETETRAACETICACIDEGFPERLHANGC乎∞NTTUORESENTPROTEINFBSFETALBOVINESENIMHSVHERPESSIMPLEXVIRUSHTERTHUMANTELONERASEL℃VELSENANSCRIPTASEMOIMULTIPLICITYOFIN_FECTIONMRNAMESSENGERR／BONUCICIEACIDPAGEPOLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESISPBSPHOSPHATEBUFFEREDSALINEPCRPOLYMERASECHAINREACTIONPFUPLAQUEFORMATIONUNITPKPROTEINK誼SES1中文全稱氨芐青霉素細(xì)胞病變效應(yīng)條件增殖型腺病毒3，3。二氨基聯(lián)苯胺DI．IMCCCO改I曼EAGLE培養(yǎng)基二甲基亞砜脫氧核糖核酸脫氧核糖核苷三磷酸溴化乙錠乙二胺四乙酸增強(qiáng)型綠色熒光蛋白胎牛血清人單純皰疹病毒人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶感染復(fù)數(shù)信使核糖核酸聚丙烯酰胺凝膠電泳磷酸鹽緩沖液聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)感染復(fù)數(shù)蛋白激酶

簡介：點擊查看更多煤工塵肺對大鼠認(rèn)知功能及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響.pdf精彩內(nèi)容。