簡介：點擊查看更多CTLA4Ig腺相關(guān)病毒體系的構(gòu)建及誘導大鼠動脈化部分肝移植免疫耐受的實驗研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目錄縮略詞表1中文摘要2ABSTRACT4前言6刖吾材料和方法81材料82方法一L3結(jié)果28討論34結(jié)論40論文圖片4L參考文獻54綜述”60攻讀碩士學位期間發(fā)表學術(shù)論文題目一72臨床培訓小結(jié)73致謝75論文獨創(chuàng)性聲明”76論文使用授權(quán)聲明”76論文審閱認定書”77徐州醫(yī)學院碩士學位論文慢性氟中毒所致大鼠認知功能障礙的機理研究中文摘要目的建立慢性氟中毒模型，研究慢性氟中毒所致大鼠認知功能障礙的機理。方法用含不同濃度的氟化鈉O、50、100、150MG／L的蒸餾水喂養(yǎng)WISTAR大鼠6個月建立慢性氟中毒模型，采用V型迷宮和曠場分析實驗檢測模型大鼠的認知行為功能改變；采用硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛MDA含量，亞硝酸鹽法檢測超氧化物歧化酶SOD活力水平通過HE染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元的變化；通過逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR和WESTERNBLOT方法觀察細胞凋亡相關(guān)基因B細胞淋巴瘤／白血病BCL2和白細胞介素1P轉(zhuǎn)換酶ICE在慢性氟中毒大鼠腦組織中MRNA和蛋白的表達水平；通過酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA和免疫組化方法分別檢測血清中髓鞘堿性蛋白MBP的含量和觀察腦組織中MBP的表達。結(jié)果1染氟組大鼠Y型迷宮學習記憶成績低于正常對照組尸O05，中、高氟組表現(xiàn)更為明顯PO01，隨著訓練次數(shù)的增加，染氟組學習成績提高。2與正常對照組相比，染氟組大鼠曠場試驗中央格停留時間明顯增高PO05，跨格次數(shù)及站立次數(shù)減低尸O05；并且中央格停留時間隨著訓練天數(shù)的增加而減少，而跨格次數(shù)及站立次數(shù)隨著訓練天數(shù)的增加而增加。3低、中、高氟中毒組腦組織MDA含量分別為3454053、3854042、4264O19NMOL／MGPROT，高于正常組2274022NMOL／MGPROTPO05，并且腦組織中MDA的含量和染氟濃度呈正相關(guān)R0829，P005。而低、中、高氟中毒組SOD水平分別為167士291、1454243、1294204U／MGPROT，低于正常對照179479U／MGPROT尸005，腦組織中SOD的含量和染氟濃度呈負相關(guān)產(chǎn)0678，P005。4低、中、高氟中毒組血清MBP濃度分別為4614039、6034017、7724016NG／ML，明顯高于正常組3354022NG／MLJPO05；并且血清中MBP的含量2

簡介：為了了解福建省H3N2亞型流感病毒基因進化過程，從分子生物水平上認識其變異特征和規(guī)律，并分析疫苗對福建省人群保護的效果，本次研究對1996～2011年福建省流感監(jiān)測情況進行了描述，同時選用了64株分布于1996～2011年間的福建省H3N2亞型流感毒株來進行分子流行病學特征研究。首先通過MDCK細胞和雞胚分離的方法來擴容病毒量少的病毒株，采用紅細胞凝集（HA）和紅細胞凝集抑制（HI）試驗來對病毒株進行鑒定和分型，其次通過PCR和測序方法獲得64株H3N2亞型流感病毒HA1區(qū)序列，最后運用生物信息學和統(tǒng)計學軟件來分析獲得的序列資料，在此基礎(chǔ)上進行分子流行病學研究，結(jié)合監(jiān)測數(shù)據(jù)來揭示H3N2亞型流感在福建省的流行規(guī)律和特征。結(jié)果顯示，福建省流感流行存在冬春季和夏季兩個高峰，ILI的異常增加在一定程度上可以提示流感流行的風險。1996～2011年期間，福建省流感流行優(yōu)勢株存在H1N1、H3N2和B型流感之間交替的規(guī)律。福建省1996年以來的H3N2亞型流感病毒基因進化可以分為兩個譜系，1996～2000年譜系和2002～2011年譜系，其進化規(guī)律都是沿著樹枝主干隨著時間推移向上延伸，序列的差異和年代成正比，初步判斷2000～2002年福建省H3N2亞型流感病毒抗原性發(fā)生較大轉(zhuǎn)變。1996年以來福建省H3N2亞型流感病毒HA1區(qū)共計在91個位點出現(xiàn)過變異，其中有25個氨基酸位點變異發(fā)生5個抗原決定簇上；7個變異位點發(fā)生在受體結(jié)合位點（RBS）及其附近；59個變異位點發(fā)生在抗原決定簇和RBS以外的位點，其中13個位點變異涉及年代間流感毒株的轉(zhuǎn)換，值得高度關(guān)注。與WHO推薦疫苗株比較，1996～1999年和2005～2009年疫苗對福建省H3N2亞型流感的保護效果較好，而2000～2004年疫苗保護效果不佳，存在滯后現(xiàn)象。從HA1蛋白結(jié)構(gòu)上分析，1996～2011年潛在糖基化位點有增多的趨勢，而5個二硫鍵位點氨基酸密碼子仍然保守，這均為維持HA蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起到重要作用。本次研究較詳細地對1996～2011年福建省H3N2亞型流感病毒進行分子流行病學分析，闡明了HA1基因的特征和進化情況，結(jié)合福建省流感日常監(jiān)測可為我省流感流行的預測、傳染源追蹤、疫苗篩選和流感防控提供科學依據(jù)，同時為今后進一步開展流感分子生物學研究奠定重要基礎(chǔ)。

簡介：點擊查看更多乙型肝炎病毒pres-,2--s基因(ayw亞型)轉(zhuǎn)基因小鼠的建立.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：Y9020G2單位代碼Q學號墨2QQL西弗蟲學碩士學位論文考慮免疫反應(yīng)的病毒動力學模型的全局性態(tài)論文作者指導教師學科專業(yè)研究方向提交論文日期論文答辯墨期學位授予單位龐海燕王穩(wěn)地教授應(yīng)用數(shù)學生物數(shù)學2006年4月目2006年月目西南大學中國重慶2006年4月GLOBALPROPERTIESOFVIRUSDYNAMICSMODELWITHIMMUNERESPONSEABSTRACTⅣ可ORAPPLIEDMATHEMATICSSPECIALITYBIOLOGICALMATHEMATICSSVPEMISORWANGWENDIAUTHORPANGHAIYANS200353ZIINTHISPAPER，THEGLOHALPROPERTIESOFTHEVIRUSDYNAMICSMODELSWITHIMMUNERESPONSEARESTUDIEDINTHEFIRSTPARTOFTHISPAPER，THEGLOBALPROPERTIESOFTHEVIRUSDYNAMICSMODELWITHANTIBODYIMMUNERESPONSEARESTUDIEDBYMEANSOFLYAPUNOVFUNCTIONS，THEGLOBALPROPERTIESOFTHEMODELAREOBTAINEDTHEVIRUSISCLEAREDIFTHEBASICREPRODUCTIONNUMBERR0蔓1，ANDTHEVIRUSPERSISTSINTHEHOSTIF凰1FURTHER，POSITIVESOLUTIONSOFTHEMODELAPPROACHTOANIMMUNEFREESTEADYSTATEIFTHEIMMUNERESPONSEREPRODNCTIVENUMBERR1≤1ANDTOALLENDEMICSTEADYSTATEIFRL1INTHESECONDPART，THEGLOBALPROPERTIESOFTWOYIRUSDYNAMICSMODELSWITHCTLIMMUNERESPONSEARESTUDIEDIFTHESUSCEPTIBLECELLSPROLIFERATELINEARLYTHEVIRNSISCLEAREDIFTHEBASICREPRODUCTIONNUMBER凰≤1，ANDTHEVIRUSPERSISTSINT11EHOSTIF凰1；FURTHER，POSITIVESOLUTIONSOFTHEMODELAPPROADLTOAFIIMMUNEFREESTEADYSTAREIFTILEILLLNLUUERESPONSEREPRODUCTIVENUMBERRLS1ANDTOANENDEINICSTEADVSTATEIFR11IFTHESUSCEPTIBLECELLSPROLIFERATELOGISTICALLY，THEVIRUSISCLEAREDIFTHEBASICREPRODUCTIONNUMBERRO≤1SUFFICIENTCONDITIONSFORTHEAS3RMPTOTICALSTABILITYOFANIMMUNEFLEEEQUILIBRIULNANDANENDEMICEQUILIBRIUMAREOBTAINEDWHENTHEIMMUNEFREEEQUILIBRIUMISUNSTABLEINTHEABSENCEOFTHEENDEMICE“11ILITRIUNLFNⅡNEIJCSIMULATIONSSHOWTHATHOPFBIFURCATIONMAYOCCUF；IFTHEENDEMICEQUILIBRIUMISLMSTABLE、NUMERICSIMULATIONSSHOWTHATANDHOPFBIFURCATIONDOESNOTOCCURBUTCOMULICATEDD、。NALNICALBEHAXIOROF、CLLRS

簡介：乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV感染在全球超過3億人。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，該科具有部分雙鏈環(huán)狀的DNA基因組。HBV通過特有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進行復制。HBV編碼的聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶REVERSETRANASE，RT的結(jié)構(gòu)和功能在其復制過程中起重要作用。但是，至今具有酶活性的HBVRT仍不能足量表達用于體外生化研究和晶體學分析。此外，也沒有合適的體外感染系統(tǒng)用于分析復雜的HBV復制周期。通過對分離自乙肝病人的兩株B基因型HBV的全基因組克隆和基于細胞轉(zhuǎn)染的復制效率測定，我們曾報道HBVRT第306位脯氨酸RTP306置換為絲氨酸或其他氨基酸時，大部分變異體的復制效率下降。為闡明這些變異體復制效率下降的機理，我們首先構(gòu)建－C基因型毒株的RTP306變異體并轉(zhuǎn)染HUH7細胞，然后比較變異體與原毒株的復制能力、轉(zhuǎn)錄水平和PGRNA包裝效率。通過基于細胞轉(zhuǎn)染的復制效率測定發(fā)現(xiàn)RTP306變異體復制效率下降，而且RT變異體與RT缺失復制子RTW58的反式補充實驗也證實這一現(xiàn)象。為深入了解復制效率下降的機理，首先分析變異體和原毒株的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示各RTP306變異體具有相似的轉(zhuǎn)錄水平。而且WESTERN印跡顯示RTP306氨基酸置換并不影響RT穩(wěn)定性。我們通過特異性的PGRNA包裝實驗和內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)分析HBVRT的兩大主要功能參與PGRNA包裝和催化核苷轉(zhuǎn)移合成子代病毒DNA。PGRNA包裝效率用細胞內(nèi)衣殼顆粒量校正后的衣殼顆粒內(nèi)PGRNA量表示，細胞內(nèi)衣殼顆粒用抗衣殼蛋白抗體進行WESTERN印跡測定。包裝實驗結(jié)果顯示大部分RTP306變異體的PGRNA包裝效率下降。這一結(jié)果也被內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)所確認。同時，通過內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)發(fā)現(xiàn)一些RTP306氨基酸置換導致RT核苷轉(zhuǎn)移酶活性下降?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，我們推測除了RTP306外，RTP306附近的氨基酸RT304311對HBV復制同樣重要。通過將RT304311位氨基酸置換為丙氨酸或苯丙氨酸構(gòu)建變異體并測定其復制效率，我們發(fā)現(xiàn)RT304311置換確實導致HBV復制效率明顯下降。相關(guān)機理不是轉(zhuǎn)錄水平或RT穩(wěn)定性改變而是PGRNA包裝效率下降。作為對照，遠離RTP306的氨基酸RT336和RT346置換不影響病毒復制效率。據(jù)我們所知，這是首次報道RT304311氨基酸保守在PGRNA包裝中起重要作用。此外，與原毒株相比，RTY305A變異體對抗病毒藥阿德福韋的敏感性下降。阿德福韋據(jù)報道作用于HBVRT“手掌”域的酶活性中心，而RTY305置換位于HBVRT“拇指”域，因此藥敏實驗提示RT304311氨基酸置換可能改變HBVRT構(gòu)型從而導致與抗病毒藥的親和力下降。此外，通過生物信息學方法分析RT304311對HBVRT和HBV復制的作用，結(jié)果顯示1預測RT304311位于HBVRT“拇指”域一螺旋轉(zhuǎn)角螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角上，這一螺旋轉(zhuǎn)角螺旋結(jié)構(gòu)稱為螺旋鉗基序；2轉(zhuǎn)角氨基酸在已報導的基因型AH毒株中非常保守；3部分HBVRT轉(zhuǎn)角氨基酸在逆轉(zhuǎn)錄病毒RT和丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶的螺旋鉗基序中保守。螺旋鉗基序是真核生物、細菌和病毒的核酸聚合酶拇指域中一共同的結(jié)構(gòu)元件，在聚合反應(yīng)時可結(jié)合核酸模板和引物。因此，我們通過生物學和結(jié)構(gòu)生物信息學方法確認了HBVRT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角RT304311，該轉(zhuǎn)角作為一新功能區(qū)可能通過控制HBVRT與核酸的親和力來調(diào)節(jié)HBVPGRNA包裝效率。人免疫缺陷病毒HUMANIMMUNODEFICIENCYVIRUS，HIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬的研究模型。與HBV相似，HIV也通過特有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進行復制。為研究HIVRT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角是否在HIV復制中起重要作用，以一HIV前病毒質(zhì)粒基礎(chǔ)上將HIVRT轉(zhuǎn)角置換為丙氨酸。通過單周期感染實驗檢測各變異體的復制能力。初步結(jié)果顯示HIV1轉(zhuǎn)角變異體RTY271A和RT1274A不能在JURKAT細胞內(nèi)復制。而且，HIV1RT轉(zhuǎn)角變異體RTY271A和RT1274A與DNA模板引物結(jié)合能力下降。總之，HBVRT和HIVRT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角在病毒復制過程中起重要作用并且可以作為抗病毒藥物設(shè)計的新靶點。目前，已注冊的抗HBV藥物如拉米呋啶，阿德福韋酯和恩替卡韋都是作用在HBVRT催化中心的核苷酸類似物。長期使用這些藥物將導致耐藥株的出現(xiàn)。因此迫切需要發(fā)展新的抗HBV藥物。在篩選針對HBVRT和HIVRT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角的化合物時，我們發(fā)現(xiàn)一種非核苷類似物KM12萘磺酸，4羥基75羥基64肉桂酸苯基偶氮7磺酸2萘基氨基羰基氨基34肉桂酸苯基偶氮2NAPHTHALENESULFONICACID，4HYDROXY75HYDROXY64CINNAMYLPHENYLAZO7SULFO2NAPHTHAIENYLAMINOCARBONYLAMINO34CINNAMYLPHENYLAZO曾被報道通過與已知非核苷類似物不同的機制有效地抑制HIVRT。而且，據(jù)推測，KM1針對HIVRT的“拇指”域。因此，我們采用多種方法評價KM1的抗HBV活性。通過內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)發(fā)現(xiàn)KM1抑制野生型HBVRT及其對三磷酸拉米呋啶耐藥的變異體RTL180MM2041，50％抑制濃度分別為26ΜM和05ΜM，因此KM1通過與三磷酸拉米呋啶不同的機制抑制HBVRT。通過基于細胞轉(zhuǎn)染的復制效率測定發(fā)現(xiàn)KM1抑制野生型HBV及其變異體RTL180MM2041在細胞內(nèi)復制，50％抑制濃度分別為312ΜM和95ΜM。此外，KM1有一定細胞毒性，50％細胞毒濃度為105ΜM。因此，設(shè)計能與RT拇指區(qū)甚至拇指區(qū)螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角結(jié)合的新化合物有望發(fā)展成新的抗HBV或抗HIV藥物。

簡介：分類號分類號R592學校代碼學校代碼10392學科專業(yè)代碼學科專業(yè)代碼100204學號號1101003063福建醫(yī)科大學博士研究生畢業(yè)論文APOE4通過影響通過影響NMDA受體功能受體功能加劇加劇5XFAD小鼠認知小鼠認知功能障礙功能障礙APOE4EXACERBATEDTHECOGNITIVEDYSFUNCTIONOF5XFADMICETHROUGHINFLUENCINGTHEFUNCTIONOFNMDARECEPTS學位類型型醫(yī)學博士醫(yī)學博士所在學院院協(xié)和臨床學院協(xié)和臨床學院研究生生劉德山劉德山學科學科、專業(yè)專業(yè)神經(jīng)病學神經(jīng)病學導師師陳曉春陳曉春教授教授研究起止日期研究起止日期2010年10月至月至2013年7月答辯日期答辯日期2013年5月31日二○一○一三年五月2目錄英文縮略詞表2中文摘要5英文摘要7引言9第一部分APOE4通過影響NMDA受體功能加劇5XFAD小鼠認知功能障礙12前言12材料和方法14結(jié)果18討論29小結(jié)34第二部分APOE4影響海馬神經(jīng)元胞內(nèi)CA2穩(wěn)態(tài)的可能機制35前言35材料和方法37結(jié)果39討論51小結(jié)58結(jié)論59參考文獻60綜述75致謝98個人簡歷99

簡介：戊型肝炎HEPATITISEHE是繼甲型肝炎外另一種經(jīng)腸道傳播的嚴重危害人類健康的病毒性肝炎戊型肝炎病毒HEPATITISEVIRUSHEV是其病原體為單股正鏈RNA病毒明確HEV的基因型對于戊型肝炎的診斷、預防及流行病學具有重要意義針對HEV基因分型的現(xiàn)狀本研究通過設(shè)計通用性引物嘗試利用逆轉(zhuǎn)錄巢式聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR擴增各基因型HEV基因組部分序列并與文獻已報道的通用性引物擴增的PCR片段比較篩選最適的HEV基因組區(qū)段以替代全序列進行HEV基因分型從而統(tǒng)一用于HEV基因分型的基因組區(qū)段同時利用全基因序列計算所得數(shù)據(jù)建立用于HEV基因分型的基因同源性及遺傳距離的標準并在基因分型的同時提出統(tǒng)一的命名規(guī)則使HEV基因分型進一步標準化本研究實驗內(nèi)容主要包括以下兩部分一、基于不同基因組區(qū)段進行HEV基因分型根據(jù)GENBANK中已登錄的37株不同基因型HEV全序列在HEV序列保守區(qū)設(shè)計MJA、MJB、MJC、MJD4組引物同時檢索文獻找出其它已有報道的20組通用性引物通過兩因素及單因素統(tǒng)計學方法分析基于24組引物擴增區(qū)段的基因同源性和遺傳距離數(shù)據(jù)與基于全序列的數(shù)據(jù)在不同基因型及同一基因型內(nèi)有無差異找出與全序列無統(tǒng)計學意義的區(qū)段比較基于該區(qū)段及基于基因組全序列進行的系統(tǒng)進化分析結(jié)果進一步證明該區(qū)段可替代全序列用于基因分型依據(jù)全序列計算所得的遺傳距離、基因同源性建立HEV的分型標準以系統(tǒng)進化分析驗證二、通用性引物RTPCR擴增不同基因型HEV用篩選得到的最適引物MJC進行RTPCR擴增ⅠⅣ型HEV標準株檢測其通用性并用于HEVIGM陽性的臨床標本RTPCR檢測及基因分型本研究通過生物信息學及統(tǒng)計學方法分析成功篩選出位于HEVRNA多聚酶功能域的基因組區(qū)段42544560NT可以替代HEV基因組全序列進行基因分型該區(qū)段側(cè)翼序列保守可用于擴增不同基因型HEV同時基于全基因組序列分析建立HEV基因分型標準為基因型間遺傳距離大于030核苷酸差異大于24％基因亞型間遺傳距離大于011核苷酸差異大于10％此外本研究首次明確提出HEV基因型的系統(tǒng)命名法以羅馬數(shù)字和26個英文小寫字母分別作為基因型及基因亞型序號以毒株分離時間先后作為命名順序上述標準的建立必將解決HEV基因分型中的眾多分歧進一步完善與促進HEV基因分型的研究

簡介：目的本研究通過人工合成HPV16E7多肽制備抗HPV16E7多肽卵黃抗體IGY并經(jīng)胃蛋白酶消化后獲得IGYFAB’片段進一步研究IGYFAB’片段的生物活性和穩(wěn)定性。研究方法與結(jié)果根據(jù)前期所針對HPV16E7蛋白的MHCΙ抗原結(jié)合表位利用蛋白質(zhì)軟件分析方法以前期篩選出的3段一致性較高及免疫原性較強的HPV16E7多肽序列做為研究對象氨基酸序列分別為CCKCDSTLR、GIVCPICSQ、LLMGTLGIV。采用固相合成多肽方法在自動多肽合成儀上分別合成多肽最后經(jīng)HPLC純化多肽合成純度均98％分子質(zhì)量經(jīng)MS分析分別為102824、9194、9162。并與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)作為抗原免疫產(chǎn)蛋雞制備抗多肽HPV16E7IGY多克隆抗體采用聚乙二醇三步沉淀法與卵黃液比例為16PH值為72時所提取分離特異性抗體的純度比聚乙二醇二步沉淀法純度高經(jīng)SDSPAGE電泳分析結(jié)果IGY重鏈分子量約為64KDA的和輕鏈分子量約26KDABSCAN軟件分析純度達到854離子交換層析進一步純化抗體純度大于91。間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗體效價抗體效價分別為16250013125001312500。選取最高效價的抗HPV16E7BIGY抗體進一步用胃蛋白酶消化IGY在質(zhì)量比120消化時間為9H后可獲得單一的IGYFAB’片段進一步純化IGYFAB’片段純化的FAB’片段蛋白濃度為0762MGML純度為92SDSPAGE電泳結(jié)果顯示FAB’的相對分子質(zhì)量為44KDA效價達到132000在相同的包被抗原濃度與抗體稀釋度的條件下與HPV16E7IGY抗體相比IGYFAB’片段的活性仍能保持在65以上在耐酸、耐堿等穩(wěn)定性研究中IGYFAB’片段在65℃、PH3、在堿性環(huán)境下活性仍能保持穩(wěn)定無明顯變化。結(jié)論最終合成抗HPV16E7相關(guān)多肽與BSA偶聯(lián)后作為免疫原制備了高效價的抗HPV16E7相關(guān)多肽多克隆IGY抗體進一步獲得純度較高的IGYFAB’片段仍能保留較高的生物活性穩(wěn)定性較高。

簡介：目的本課題前期研究發(fā)現(xiàn)腺病毒介導的組織激肽釋放酶1HTK1基因過表達具有部分抑制血管平滑肌細胞增殖和改善血管再狹窄的作用但聯(lián)合基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物TIMP對血管平滑肌細胞增殖是否具有協(xié)同效應(yīng)目前尚不明了。本課題首先構(gòu)建含HTK1和HTIMP1雙基因共表達的重組腺病毒載體和含基因HTIMP1的重組腺病毒載體并檢測病毒滴度。隨后觀察比較雙基因共表達載體與單基因表達載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)血管平滑肌細胞VSMCS后測定其感染率以及對血小板源性生長因子PDGFBB誘導VSMCS增殖的影響。方法第一部分1、由INVITROGEN公司購買含HTIMP1基因的原始質(zhì)粒經(jīng)鑒定后選擇相對應(yīng)內(nèi)切酶酶切HTIMP1基因片段和含強綠色熒光蛋白基因EGFP穿梭質(zhì)粒PDC316EGFP經(jīng)連接熱激、轉(zhuǎn)化及構(gòu)建含HTIMP1和EGFP基因的重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切和測序分析進行鑒定。2、對含HTIMP1重組穿梭質(zhì)粒應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BGⅢSAⅡ進行酶切并擴增、回收含啟動子CMV的片段CMVHTIMP1片斷選擇對應(yīng)酶切位點同時酶切質(zhì)粒PDC316HTK1載體本研究室保存并回收并將上述產(chǎn)物進行連接、熱休克法轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5?后挑取正確克隆構(gòu)建含雙啟動子和雙基因的重組穿梭質(zhì)粒。經(jīng)PCR、酶切分析和測序分析進行鑒定該質(zhì)粒。3、將上述兩個重組穿梭質(zhì)粒線性化并同腺病毒骨架質(zhì)粒PBHGLOXE13CRE轉(zhuǎn)染293A細胞在293A細胞包裝含HTIMP1基因和HTK1和HTIMP1雙基因的重組腺病毒載體并經(jīng)PCR鑒定毒種中的目的基因以經(jīng)典TICD50法測定病毒滴度。第二部分1、組織塊貼壁法體外培養(yǎng)SPRAGUEDAWLEYSD大鼠胸主動脈VSMCS觀察細胞生長狀態(tài)并用ALPHASMOOTHMUSCLEACTIN單克隆抗體經(jīng)細胞免疫組化法鑒定正確性。2、熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測重組腺病毒感染率。3、細胞計數(shù)法和四甲基偶氮唑鹽MTT比色法分別檢測細胞增殖改變。結(jié)果第一部分1、經(jīng)PCR法、雙酶切法和測序三種方法檢測證實含HTIMP1和EGFP的重組穿梭質(zhì)粒PDC316HTIMP1EGFP和含HTK1和HTIMP1基因的PDC316CMVHTK1CMVHTIMP1構(gòu)建正確。2、上述兩個重組穿梭質(zhì)粒分別與骨架質(zhì)粒PBHGLOXE13CRE在293A細胞中成功包裝了含HTIMP1的AD5HTIMP1EGFP重組腺病毒載體和含HTK1和HTIMP1基因的AD5HTK1HTIMP1重組腺病毒載體并經(jīng)毒種PCR證實了目的基因正確性。3、經(jīng)TICD50法測定兩種重組腺病毒滴度AD5HTIMP1EGFP為701011VPMLAD5HTK1HTIMP1為851011VPML。第二部分1、成功原代培養(yǎng)了大鼠VSMCS細胞呈梭形、紡錘形710天細胞彼此融合呈束狀排列部分出現(xiàn)旋窩“峰和谷”樣的生長模式經(jīng)細胞免疫組化鑒定胞漿內(nèi)ASM免疫熒光陽性表達呈紅色絲狀條紋說明培養(yǎng)的細胞是血管平滑肌細胞純度達95％以上VSMCS純度高。2、AD5HTK1EGFP轉(zhuǎn)染細胞后感染率呈濃度20100MOI和時間14D依賴性增加在100MOI和第4天時最高感染率為9957?5HTIMP1EGFP的感染率同樣呈濃度20150MOI和時間15D依賴性增加在150MOI和第5天時最高感染率為9814。3、細胞計數(shù)法和MTT法結(jié)果顯示與CONTROL組相比PDGFBB可明顯促進細胞增殖生長P結(jié)論1、本研究通過雙啟動子策略首次成功構(gòu)建和包裝含HTK1和HTIMP1雙基因的共表達重組腺病毒載體AD5HTK1HTIMP1同時成功構(gòu)建含HTIMP1的重組腺病毒載體AD5HTIMP1EGFP2、轉(zhuǎn)染VSMCS后AD5HTIMP1EGFP的感染率呈濃度20150MOI和時間14D依賴性增加3、雙基因共表達載體可抑制PDGFBB誘導VSMCS的生長和增殖含雙基因HTK1和HTIMP1共表達載體的抑制效應(yīng)明顯大于單基因HTK1或HTIMP1載體這為聯(lián)合基因在心血管的基因治療中奠定初步實驗基礎(chǔ)。

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簡介：天津醫(yī)科大學碩士學位論文病毒性心肌炎小兒血清白介素10、18的表達與心臟重塑相關(guān)研究姓名王天成申請學位級別碩士專業(yè)兒科學指導教師張宏艷20050501天津醫(yī)科大學碩士研究生學位論文中文摘要【目的】研究病毒性心肌炎VIRALMYOCARDITIS，VMC患兒白細胞介素一10INTERLEUKIN10，IL10和白細胞介素18INTERLEUKIN18，IL18的表達；研究病毒性，心肌炎患JDL、功能的變化；分析患兒IL10、IL18的表達與心臟重塑、心功能CARDIACFUNCTION，CF的變化的相關(guān)性。【方法】1本研究選取的病毒性心肌炎病例，全部符合1999年9月修訂的小兒病毒性心肌炎診斷標準；對照組選白天津市兒童醫(yī)院防病外科，該組年齡、性別與病人組無差異，近期無感染且血象、心電圖和胸透正常。2采用雙抗體夾心ELISA方法檢測對照組、病人組小兒的ILLO和IL一18含量，其中對照組25例，病人組72例；病人組根據(jù)有無心衰再分為無心衰組、心衰組和休克組，根據(jù)有無心臟擴大CARDIACDILATATION，CD分為有心臟擴大組和無心臟擴大組。3應(yīng)用PI1LIP5500型超聲心動儀檢測全部病人心功能指標，記錄左室收縮末期內(nèi)徑1EFTVENTRICULARENDSYSTOLICDIAMETERLVESD、左室舒張末期內(nèi)徑1EFTVENTRICULARENDDIASTOLICDIAMETERLVEDD、左房內(nèi)徑1EFTATRIUMDIAMETERLAD、LVFS和EF等指標。4應(yīng)用SPSSLL5FORWINDOWS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。【結(jié)果】1病人組血清ILLO、IL18的表達高于對照組P005休克組、心衰組和無心衰組的左室舒張末期前后徑無顯著差異PO09005；心臟擴大、瓣膜返流、心包積液、LVFS和EF減低等其他超聲異常的發(fā)生率隨無心衰組、心衰組和休克組升高，有顯著差異P005。4血清ILLO、IL18的表達與病情分組對照組、無心衰組、心衰組和休克組呈等級正相關(guān)P005；血清ILLO的表達與心臟擴大呈等級『E相關(guān)P005；IL一18與心臟收縮功能指標LVFS、EF均呈3

簡介：目的研究腦力蘇膠囊改善VD大鼠認知障礙的作用機制方法根據(jù)PAPPASBA方法采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制作VD大鼠模型實驗大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、喜得鎮(zhèn)組、腦力蘇膠囊大、中、小劑量組治療7天后用水迷宮及跳臺實驗檢測學習、記憶情況借助光鏡、免疫組化方法等對海馬組織形態(tài)學、血漿降鈣素基因相關(guān)肽GGRP、內(nèi)皮素ET1含量、腦組織乙酰膽堿酯酶ACHE含量、海馬一氧化氮合酶NOS、生長抑素SS陽性細胞數(shù)進行觀測結(jié)果喜得鎮(zhèn)及腦力蘇大、中劑量灌胃治療后大鼠學習記憶明顯改善P001血漿ET含量明顯降低GGRP含量明顯增長P001海馬神經(jīng)元密度、ACHE含量、SS活性顯著升高NOS活性明顯降低P001結(jié)論腦力蘇膠囊能顯著改善VD大鼠學習記憶能力其可能作用機制為調(diào)節(jié)腦缺血時血漿ET1、CGRP水平減輕NOS的神經(jīng)毒性作用并抑制由此誘發(fā)的細胞凋亡刺激SS分泌促進膽堿能系統(tǒng)功能